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屈光术后角膜混浊,都有哪些“罪魁祸首”?

白内障  作者:国际眼科时讯  2020/1/16 13:51:00
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内容概要:随着人们生活水平的提高,近视患者的脱镜需求亦随之增高。

随着人们生活水平的提高,近视患者的脱镜需求亦随之增高。每年有数百万只眼睛接受不同的屈光矫正手术,如准分子激光角膜切削术(PRK)和激光辅助原位角膜磨镶术(LASIK)。

角膜混浊是一种屈光手术术后并发症,其发生率为1.44%1。角膜混浊的性质和位置与先前的手术方法相关——角膜胶原交联(CXL)与中央基质混浊有关,而PRK则会导致上皮下混浊2。尽管已有很多有关角膜混浊的特征研究,但其发病机制和诱发因素却仍知之甚少。有关PRK术后或化学灼伤后的角膜混浊的体外和体内研究主要集中在TGFβ3通路的调节、炎症4和细胞外基质重塑5方面。屈光术后角膜混浊相关的临床危险因素包括高度屈光不正、切削深度较深、切削范围较小6以及UV B的暴露7。局部类固醇应用是预防和控制角膜混浊发展最常见的预防和术后治疗方法之一。但是,研究表明,这些药物并非有效8。丝裂霉素C(MMC)也已用于治疗准分子消融术后角膜混浊并获得成功,但该药对角膜基质形成细胞和角膜内皮细胞在细胞毒性方面的安全性仍需关注9,10。
 
伤口愈合过程通常由TGF超家族11的各个成员严格控制,而这些成员又受PDGF、EGF、HGF、KGF等生长因子的调节。一旦受损,角膜基质细胞就会分化为具有修复功能(如胶原沉积和细胞外基质重塑)13的成肌纤维细胞。有证据表明,角膜上皮通过分泌细胞因子和包括TGFβ14在内的生长因子促进基质损伤的愈合和成肌纤维细胞的分化。角膜上皮分泌的因子介导角膜基质细胞的增殖并迁移至损伤部位。因此,如果角膜上皮分泌的调节因子水平失衡,则可能通过诱导过度的成纤维细胞形成、异常的胶原沉积和细胞外基质重塑而产生异常的基质细胞纤维化反应16。因此,角膜上皮可视为诱导临床屈光手术者发生术后角膜混浊的因素源头。
 
既往在人体标本中的研究一直关注于角膜移植术后纤维化角膜的情况17,18。但这些组织代表的是纤维化的最终阶段19,尚缺乏有关临床上健康人眼屈光手术后角膜混浊的分子和组织因素经验。角膜混浊的动物模型还采用了如9D PRK20和碱烧伤21(1 N NaOH)的急性损伤模型,虽然可以立即引起强烈的促纤维化反应,但却无法研究屈光手术患者的角膜在创伤修复失衡过程中原有组织特异性因子的变化情况。
 
基于以上发现,来自印度的Nimisha R. Kumar教授等对临床上正常角膜在手术后易出现异常纤维化的因素及角膜上皮的作用进行了研究,分析了屈光手术患者术前角膜上皮细胞中整体基因的表达情况。研究者将受试者分为术后12个月出现的角膜混浊组(n= 6眼;有角膜混浊倾向)和在相似随访时间内未出现角膜混浊组(n=11眼;对照组),并对二者进行了比较。在进行准分子激光消融之前,术中获取了在年龄、性别和随访时间符合要求的患者的角膜上皮,然后使用基于微阵列的基因表达分析了在角膜混浊倾向者中发生改变的新因素。
 
表1.角膜混浊患者人群统计数据。该表显示了使用Corvis-ST评估的角膜厚度和角膜形变的平均值±标准差。K1,K2:通过角膜曲率测定的角膜曲率;Km和K-Max:分别为平均角膜曲率值和最大角膜曲率值。MRSE:显然验光等效球镜,TCT:最薄角膜厚度;BADD指数:圆锥角膜严重程度的指标。ANOVA p值显示组统计信息;在结果部分配对统计。
 
图1. 该临床图像为裂隙灯生物显微镜下PRK术后的角膜。(a)对照:PRK后12个月的透明角膜,(b)混浊角膜:PRK后12个月出现2级上皮下混浊的角膜。为了使PRK后的混浊更易见,Oculus Pentacam光密度测定图显示了正常对照角膜不同区域中的绝对值(c)。显示了角膜混浊患者前120mm处0-2、2-6和6-10mm区域的灰度值(GY)增加(d)。用红色虚线为混浊区边界。角膜光密度法分析基于色标给出的不同区域绝对值。在Pentacam读数中,以表格和图形格式显示角膜密度计的平均值。该图显示了与正常角膜(c)相比,不同区域中与增加的灰度值相对应的峰值情况,而这些区域代表的是因角膜混浊导致的反向散射增加的区域(d)。
 
图2. 来自混浊倾向组和对照组mRNA样品的微阵列显示,292个上调基因和567个下调基因的变化>±2倍(p值<0.05)。(a)图代表了859个不同调节的基因数据。(b)在混浊倾向人群和PRK术后角膜混浊人群中,基因和通路不同调节情况的STRING分析结果。38个差异表达基因(三角形,分别红色表示上调和绿色表示下调)与21种分子功能(绿色圆圈)和7条重要通路(方框)相关。
 
表2. 根据功能通路分类的微阵列数据。微阵列数据中表达的基因数目与亲本基因本体相关,其差异倍数变化见上表,代表了多种功能通路。
 
对角膜混浊倾向组中1100个上调基因和1780个下调基因的分析表明,炎症、wnt信号传导、氧化应激、神经功能和细胞外基质重塑的相关通路发生了变化。PREX1、WNT3A、SOX17、GABRA1、PXDN等新发现因子在角膜混浊易患者和活动性角膜混浊(n= 3)者中均发生了显著的变化,表明它们具有促纤维化作用。在有角膜混浊倾向者中,PREX1明显上调。与对照组相比,PREX1在培养的人角膜上皮细胞中异常表达促进了伤口的愈合,使用shRNA则降低了愈合速度。在过表达PREX1的角膜细胞中,重组TGFβ可增强αSMA的表达和波形蛋白的磷酸化,而对表达shPREX1的细胞则相反。
 
图3. 术中收集角膜上皮组织的mRNA表达。(a–j)代表了PREX1、WNT3A、SOX17、JUN、IL6、TGFβ、GABRA1、PXDN、EGFR和COLIA1的不同调节转录水平。 条形图由三组构成,白色条形为对照组(n = 11)、黑色条形为角膜混浊倾向组(n = 6)、灰色条形为PRK术后角膜混浊组(n = 3)。数据为平均值±标准差(* p <0.05)
 
表3. 该表显示了对照组、角膜混浊倾向组和PRK术后角膜混浊组分别在微阵列中基因mRNA的表达情况(均值±标准差)及其在各组间的p值。
 
表4. 使用实时定量PCR检测的对照组和角膜混浊倾向组在微阵列基因情况。该表由基因名称和在患者队列中观察到的调节倍数组成,包含对照组(无角膜混浊的正常PRK)和角膜混浊倾向组(发生角膜混浊的正常PRK)组成。p值显示具有统计学差异。
 
图4.过表达的PREX1促进了培养的人角膜上皮细胞(HCE)的迁移。在HCE细胞中,以空质粒作为对照,进行可以使PREX1(ORF)过表达的脂质体转染。对HCE进行搔刮后,(a)在0、8、16和24小时显微拍照。(b)空对照和 PREX1 ORF中缺损区域修复分析。(c)以α-微管蛋白为内参,蛋白印迹法显示PREX1蛋白的表达情况(摘自补充图2a,泳道3和4源自印迹实验1&2,以白框表示)。q-PCR分析显示(d–g)PREX1、FN、ACTA2和CTGF的倍数变化,以均值±标准差表示(* p <0.05)。(h)TGFβ对PREX1过表达的培养人上皮细胞和空质粒对照的影响。有或无TGFβ转染处理细胞24小时。以GAPDH作内参,蛋白印迹法显示PREX1、p-波形蛋白、总波形蛋白、α平滑肌肌动蛋白(ACTA2)、纤连蛋白(FN)的蛋白表达水平。
 
图5. 在培养的人角膜上皮细胞(HCE)中,PREX1敲除可延迟伤口的闭合。以转染短发夹(Sh)质粒进行PREX1敲除,以干扰质粒作对照。(a)显示在搔刮0、8、16和24小时后损伤情况的显微照片。(b)分别为对照组和Sh-PREX1转染细胞中损伤区域修复分析。(c)Western印迹显示了干扰对照组和sh-PREX1转染组细胞中PREX1蛋白的表达水平(摘自补充图2b,泳道6和7源自印迹实验3&4,以白框表示)。q-PCR显示PREX1、FN、ACTA2和CTGF的倍数变化(d–g)。以均值±标准差表示(* p <0.05)。(h)在PREX1敲除和干扰质粒对照组中,TGFβ对HCE细胞的影响。有或无TGFβ转染处理细胞24小时。以GAPDH作内参,免疫印迹法显示PREX1、纤连蛋白(FN)、α平滑肌肌动蛋白(ACTA2)、p-波形蛋白、总波形蛋白的蛋白表达水平。
 
应当指出的是,该研究结果仅在角膜上皮中可行,因为标本是在手术过程中清除的。这项研究首次揭示了一系列角膜上皮中的因素,这些因素的原有水平可能作用或影响角膜组织中已知的纤维化机制,从而导致术后伤口的异常愈合和混浊。这些因素可能决定了患者发生屈光术后角膜混浊的风险。
 
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