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视网膜类器官-研究RP的新型利器

玻璃体视网膜  作者:国际眼科时讯  2020/5/9 11:40:00
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内容概要:视网膜色素变性(RP)的患病率约为1 / 4000,全世界大约共有150万患者

视网膜色素变性(RP)的患病率约为1 / 4000,全世界大约共有150万患者。RP是一种遗传性视网膜退行性疾病,其特征是光感受器细胞的不可逆损失。在细胞水平上,RP与视杆细胞的首先变性有关。在该病的进展过程中,视锥细胞也可能受到影响,最终导致日间视力障碍或完全失明。视杆细胞cGMP-磷酸二酯酶6型β亚基编码(PDE6B)基因突变的患者占常染色体隐性遗传RP的4 - 5%。也有研究占2.4%。

在动物RP模型中可以观察到视杆和视锥细胞的逐渐丧失,同时伴有cGMP浓度的升高和Ca2+通过CNG通道流入,这与人类疾病的表型相似。但是不同物种间存在差异。因此近来用患者特异性的诱导多能干细胞(iPSCs)与分化技术相结合,为疾病建模提供了无限的细胞来源,并可在适当的诱导后模拟原发疾病组织。利用人类胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(iPSCs)已经成功地分化出了视网膜类器官(Retinal organoid, ROs)。这些ROs在培养皿中产生,具有适当的视网膜神经标记物,形成视网膜的层次结构,甚至具有光反应。
 
早发性视网膜变性的ROs疾病模型既往已经被建立过。在RPGR和CEP290突变ROs中发现视网膜发育和光感受器纤毛的缺陷。而在本研究中,温州医科大学眼视光医院金子兵团队构建了一个包含PDE6B突变的ROs模型来研究迟发性RP的特征。相关研究文章“Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa”发表在Front Cell Dev Biol杂志上。
 
携带PDE6B突变的患者特异性诱导多能干细胞的构建和鉴定选取一名因夜盲在40多岁才被诊断为RP的患者,其来自于一个近亲家系(图1A),在OCT上能发现明显的感受器层消失(图1B)。对患者进行靶向测序,发现PDE6B的纯和突变(c.694G > A),并经过Sanger测序验证(图1C)。这一突变位于两个GAF结构域的序列中,这两个结构域是串联排列的,导致谷氨酸转变为赖氨酸(232E-K)(图1D和E)。这个氨基酸在各种物种间具有保守性(图1F)。
 
采患者及一正常对照的外周血,用血液单核细胞进行iPSC的诱导(图2A)。对来自患者和对照组的3个iPSC系检测了AP染色和多能性标记(图2B和C)。三系分化表明,来自患者和对照组的iPSC能够分化为三个胚层(图2D)。以上结果证明了患者特异性诱导多能干细胞的成功构建。
 
图1. PDE6B突变的RP患者
 
图2. RP患者和正常正常iPSC的构建的鉴定
 
构建视网膜类器官的疾病模型
 
患者和对照组的iPSCs分化的RO在D180前都表现出相似的形态和视网膜神经结构(图3A)。视网膜分层结构在D180已经清楚可见(图3A)。Brn3b在视网膜神经节细胞(RGCs)中表达,VSX2在视网膜祖细胞(RGCs)中表达。PAX6具有广泛的表达,包括RPCs、RGCs、无长突和水平细胞。在这里,研究者选择了Brn3b、PAX6和VSX2作为视网膜类器官早期阶段RGC和RPC的标记。Brn3b、PAX6和VSX2在D45时在患者和对照组ROs中的表达相似(图3B)。
 
CRX在光感受器前体细胞和成熟光感受器中表达,NRL在视杆前体细胞和成熟视杆细胞中表达。在ROs早期,CRX和NRL作为光感受器前体细胞和视杆前体细胞的标记物。D60时CRX表达在患者和对照中无明显差异,D120时NRL表达无明显差异(图3B)。光感受器细胞特异性标记CRX在D60时在内层和外层均有表达(图3B),在D105时主要在外层(图3C),表明其具有类似于体内早期视网膜的层次结构。RCVRN的表达大约在D60时出现,并随着ROs的发展而增加(图3C)。在D105时,大多数CRX+感光细胞与RCVRN共表达(图3C),这与之前的报道一致。免疫染色分析显示,ROs具有视网膜发生发展的过程,在D120前,患者和对照组的视网膜前体细胞或感光细胞无明显差异。然而,随着RO的发展,患者与对照组ROs视杆细胞的标记(RHO)和视杆双极细胞的标记(PKCɑ)在D180时有明显的差异(图3C)。因此,患者ROs构建成功,并表现出明显的视杆细胞缺陷。
 
图3. 患者和对照ROs的视网膜发育对比
 
晚期PDE6B患者视网膜类器官的转录组分析
 
为了研究PDE6B的突变c.694G>A对转录的影响。对患者和对照组的ROs进行整体的RNA测序,从中期(D90、120、150和180)到晚期(D230)。与其他测序时间点相比,在D230时,患者和对照组之间共发现2578个差异表达基因(图4A)。而在这些基因中,有968个在其他时间点中没有(图4B)。这一结果与之前的形态学和免疫染色结果一致,说明在中期患者的ROs中出现了轻微的改变。此外,相关分析也证实了患者ROs在D230时与其他时间段ROs的差异(图4D)。这些结果提示PDE6B的突变c.694G>A可能导致迟发性的视网膜疾病,与RP临床表型一致。
 
图4. D230时患者和对照ROs的转录组学分析
 
患者晚期视网膜类器官中视杆细胞的定位改变
 
为了进一步分析晚期PDE6B患者ROs的缺陷,研究者比较了患者和对照组ROs不同视网膜细胞类型的基因表达谱,包括RGCs、双极细胞、水平和无长突细胞、光感受器细胞(图5A)。在这些视网膜细胞类型中,与光感受器细胞发生相关的基因表达,特别是视杆细胞的标记物在患者ROs中的表达明显高于对照组(图5A)。促进视杆细胞发育的转录因子或调节因子(SAG、NR2E3和NRL)以及与光转导相关的基因在患者ROs中期阶段升高,但在后期下降到与对照组相类似的水平(图5A)。这些基因表达的异常提示患者ROs视杆细胞的发育存在缺陷。
 
对照组ROs中,RHO+视杆细胞和M-视蛋白+视锥细胞主要位于外层,呈外节段样结构,说明感光细胞形态成熟。而在患者ROs中,RHO和M-视蛋白多出现在内层,且形态未成熟(图5B)。RCVRN阳性细胞和DAPI很清楚地显示外层结构(图5C)。TUNEL阳性细胞很少,在D180或D230时在两组中也未见明显差异(图5C)。3个ROs(每个6张)的统计分析表明,对照组ROs的内、外层视杆细胞比例明显高于患者ROs(图5D)。因此,以上结果提示PDE6B的突变解除了ROs中期视杆细胞标记物的表达限制,并特异性地破坏了ROs晚期视杆细胞的成熟,细胞死亡可能不是导致视杆细胞定位改变的主要原因。
 
图5. D230时患者ROs视杆细胞迁移能力的缺陷
 
PDE6B患者视网膜类器官的功能缺陷
 
PDE6B在cGMP水解中起重要作用,是光转导的关键部分。对D230时患者和对照组的ROs转录组显著差异结果进行GO分析,发现了G蛋白偶联受体活性、G蛋白偶联受体信号通路和钙离子结合相关基因的富集(图6A)。在D230患者的ROs上,GNAT1,PDE6B和PDE6G,以及促进cGMP水解的环GMP磷酸二酯酶β和γ亚基均表达升高(图6B)。通过qPCR验证,PDE6G, PDE6B, GNAT1, SAG和ATOH7的表达在患者ROs中均比正常ROs明显高(图6C)。RCVRN在患者和对照ROs中表达水平相似。伴随轻微不同的RCVRN表达,表明患者和对照组ROs细胞数量相似,这些异常变化意味着患者ROs在D230时cGMP水解功能受损(图6B)。D230时,cGMP-PKG信号通路相关基因的表达在患者ROs中发生了显著变化(图6D)。促进cGMP水解的成分AIPL1也明显上调(图6D)。而G蛋白偶联受体信号通路和离子通道相关的基因GNB1,GNGB3在患者ROs中表达明显下调(图6D)。这些说明患者ROs的cGMP水平受到影响。因此通过ELISA检测ROs中的cGMP,发现患者ROs中的含量明显高于正常(图6E)。因此PDE6B的突变通过损害cGMP的水解功能来升高ROs中的cGMP含量。
 
在患者和正常的ROs上能看到突触明显不同的的表达模式(图7A)。在对照组ROs中,大多数突触位于外核层两个顶端区域上。而患者ROs中则向细胞质扩散(图7A)。另外在正常ROs中能发现突触结构在视杆细胞的末端形成(图7B和C)。而患者ROs中没有发现相似结构。并通过ARL13B的表达来检测连接纤毛的结构(图7D)。发现患者的ROs中纤毛数量明显减少(图7E)。基于以上结果,在PDE6B突变的ROs中,cGMP水平升高可能与从内层到外层的视杆细胞迁移受损以及光感受器细胞中突触和连接纤毛的形成受阻有关。
 
图6. 患者ROs中光传导能力受损
 
图7. 患者ROs中视杆细胞成熟能力受损
 
综上所述,研究者利用体外细胞培养系统建立了首个与晚发型RP表型一致的模型,为PDE6B相关RP的相关机制提供了新的理论依据,并能为未来的药物筛选提供好的平台。
 
参考文献:
 
Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa. Front Cell Dev Biol. 2020 Mar 6;8:128
 
点评
 
邹绚
北京协和医院
 
使用诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)建立疾病模型是目前先进的研究手段。近年来有大量的研究工作关注iPSC作为疾病模型和在潜在治疗方式中的作用,将iPSC分化成各种不同类型细胞的技术比较成熟,为研究疾病提供了更有效的方法,现有的技术已经可以在体外将iPSC培养转化为和人视网膜相似的三维立体球形视网膜组织,记录到光电反应波、检测到视细胞标记物,甚至包含成熟的光感受器细胞。视网膜位于眼内,很难获得活体的细胞或组织用于研究病理机制。IPSC的建立使得在体外获得不同类型的细胞成为现实,使研究人员能够通过该技术对遗传性视网膜变性新基因突变的病理生理学进行研究,在疾病模型建立与机理研究、细胞治疗、药物发现与评价等方面具有非常大的应用价值。

 
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