国际眼科时讯

聚焦前沿，共探眼底病治疗新方向

2023-06-30 23:21:36
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编者按

目前感光细胞变性相关眼底疾病尚无治愈及延缓疾病进展的有效治疗方法，眼科学者们正从信号通路、视网膜假体等方面入手开展研究，希望能研发出有效治疗方式造福此类患者。在2023年视觉与眼科研究协会年会（ARVO2023）上，多位眼科学者分享了相关研究成果，拓宽了眼科医生的视野，为未来更好地治疗感光细胞变性相关眼底疾病提供了理论依据。

维甲酸信号在小鼠视网膜色素变性模型中促进锥体细胞存活和血管退化

讲题：Retinoic acid signaling promotes cone survival and vascular regression in mouse models of Retinitis Pigmentosa

作者：Ryoji Amamoto, Connie L. Cepko

Ryoji Amamoto等人探讨了维甲酸（RA）信号通路对视网膜血管系统的调控作用，这种调控作用可能是导致视锥细胞长期存活的原因。
既往研究表明，在视网膜退化过程中，内层视网膜血管发生退化，并且伴随血-视网膜屏障（BRB）破坏（图1）。研究者们首先通过视网膜铺片组织免疫荧光（IF）检测内皮细胞标记物CD31，确定了血管退化的程度。使用转盘式共聚焦显微镜观察位于内核层和外核层之间的深层丛状血管。通过IF检测IgG或经尾静脉注射的Sulfo-NHS-Biotin，检测视锥细胞退化期（P27）的BRB渗漏区域。此外，研究者还采用电穿孔技术将活性RA受体RARa-VP16转入细胞从而确定RA信号对血管的作用。
结果显示，在视杆细胞退化期间（P11-P20），深层丛状血管出现退化。有趣的是，在视锥细胞能够长期存活且RA信号活跃的周边区域，深层丛状血管完全不存在。从视锥细胞开始退化的时间点P20开始，中央视网膜存在BRB渗漏的现象。然而，在周边视网膜中并未发现渗漏，可能是因为深层丛状血管不存在。而通过电穿孔技术在中央视网膜中转入RA受体从而外源性激活RA信号，可以显著降低血管数量。
研究者认为，在周围视网膜的RA信号激活能够促进视网膜血管系统的退化，防止BRB渗漏，从而提高视锥细胞的生存率。然而，仍需更多研究来建立BRB渗漏和视锥细胞的非自主死亡之间的因果关系。

图1. 发病机制展示

小鼠眼中LAMP2亚型的表达

讲题：LAMP2 isoform expression in the mouse eye

作者：Kristyn Huffman, Paul Bushway, Angel Hermida, Ana Maria Manso, Joshua Fong, Eric Adler, Shyamanga Borooah

Danon病（DD）是一种x-连锁疾病，由溶酶体相关膜蛋白2（LAMP2）基因的功能突变缺失引起，导致自噬和吞噬作用中断。除了心肌病、智力迟钝和骨骼肌病外，DD还会导致进行性视网膜变性。LAMP2有三种亚型（2A、2B、2C），其表达具有组织特异性。Kristyn Huffman等人开展了一项研究，旨在确认小鼠LAMP2亚型在视网膜和RPE/脉络膜中的表达，表征老年LAMP2敲除小鼠（Lamp2y/-）的表型，以帮助阐明LAMP2在视网膜变性中的作用。研究者们同时也检测了基因治疗在LAMP2亚型中的表达。
研究者用qPCR方法对野生型（WT）小鼠新鲜视网膜和RPE/脉络膜上的Lamp2异构体表达进行定量（n=4）。采用全视场视网膜电图（ffERG, n=3）和视网膜冷冻切片M/S视蛋白计数（n=3），将20~24个月的Lamp2y/-小鼠的表型与年龄匹配的WT小鼠进行比较。此外，从DD患者来源的人类诱导多能干细胞（hiPSCs）中检测包含所有三个不同启动子的LAMP2亚型。
结果显示，Lamp2B和Lamp2C在视网膜中的表达分别为Lamp2A水平的80%和30%。在RPE中，Lamp2C水平为Lamp2A的20%，而与Lamp2B水平相当（图2）。在20~24个月的Lamp2y/-小鼠中，使用ffERG检测，暗点和光波形都严重减少（图2）。为了研究这一发现是由于退化还是功能障碍，研究者们对视锥细胞进行了光敏蛋白技术，两组视网膜上每mm阳性感光细胞数无显著差异（图2）。在DD hiPSCs中组成性表达的质粒中包含所有LAMP2亚型，并且表现出EF1启动相较于PGK启动子具有更好的表达（图3）。2A和2B亚型的表达高于2C。
该研究表明，尽管ffERG反应明显减弱，老龄Lamp2y/-小鼠视网膜仍然显示出与年龄匹配的WT小鼠相似的视锥细胞数量，这表明功能障碍占主导而非退化。该研究也提示，使用类似于研究中测试的基因治疗有望恢复DD患者的视网膜功能。

图2. 老年WT和Lamp2 KO小鼠的全视场视网膜电图（A）。Lamp2亚型在小鼠视网膜和RPE中的表达（B）。老年Lamp2 KO（C）和WT（D）小鼠的视蛋白染色。

图3. LAMP2基因是由相邻的外显子1-8组成，并采用内含子序列来强制LAMP2A/B/C外显子9的3'选择位点（A）。不同启动子（EF1、PGK1）类型的LAMP 2在DD患者诱导多能干细胞的表达水平（B）。

刺激选择性在视网膜下假体视力中的作用

讲题：The role of stimulation selectivity in visual acuity with subretinal prostheses

作者：Bing-Yi Wang, Mohajeet Balveer Bhuckory, Zhijie Charles Chen, Andrew Shin, Nathan Jensen, Ludwig Galambos, Keith Mathieson, Theodore Kamins, Paul Werginz, Daniel V. Palanker

光伏视网膜下假体为因年龄相关性黄斑变性而失明的患者提供形式感知，其视力与100μm像素大小非常接近。假体视觉可以通过双极细胞（BCs）的网络介导刺激或直接激活视网膜神经节细胞（RGCs）来实现，但对于每种机制如何影响形式感知尚无定论。更好地了解选择性在视网膜刺激中的作用对于指导高分辨率假体的未来发展至关重要，因此Bing-Yi Wang等人进行了该方面的研究。
研究者们将视网膜下光伏装置植入大鼠体内，包括100μm像素的双极阵列（具有局部回路电极）和40μm像素的单极阵列（在植入物边缘具有全局共同回路）。玻璃体内应用突触阻滞剂评估RGC的直接激活。有和无突触阻滞剂的条件下，皮质对近红外（880nm）刺激的反应均被测量，以评估全域刺激阈值和光栅敏锐度。COMSOL中的有限元模型和NEURON中的多室模型用于模拟相关电场下的BCs和RGCs响应。
结果显示，对于双极阵列，有突触阻滞剂时的刺激阈值约为无阻滞剂时的10倍，表明选择性刺激BCs的动态范围很大。对于单极阵列，有阻滞剂的全域阈值约为无阻滞剂的3倍。更重要的是，仅在无阻滞剂存在的情况下观察到皮质对条纹宽度低于200μm的交替光栅的反应，这表明直接刺激RGCs所提供的分辨率并不优于其感受野的平均大小。计算机模型表明，RGCs中的树突总和与轴突激活有助于在模式刺激（包括光栅和Landolt C's）下进行空间随机放电。
该研究表明，网络介导的视网膜反应可能对于视网膜下假体在模式刺激下的形式感知至关重要，而直接激活RGCs可能会引发光感知（光幻视），而不是成形的视觉。为了确保BCs在视网膜下刺激中的高选择性，需要通过硬件植入物设计和/或刺激的动态控制来精心设计电场限制。

探讨有机半导体作为视网膜假体潜在光伏材料的体外细胞毒性

讲题：In Vitro Cytotoxicity of Organic Semiconductors as Potential Photovoltaic Materials for Retinal Prostheses作者：Ahmad Salti, Ana Cetkovic, Alessandro Bellapianta, Mihai Irimia-Vladu, Markus Clark Scherber, Andrea Corna, Günther Zeck, Matthias Bolz使用有机光伏（OPV）半导体的视网膜假体是一种很有前景的治疗装置，可以在疾病晚期恢复视网膜营养不良患者的视力。然而，在将OPV材料用作视网膜植入物之前，必须对其采用适当的细胞毒性验证。
Ahmad Salti等人按照ISO 10993-5标准分别评估D18、Y6、PFN-Br、PDIN和喹吖啶酮以及D18/Y6、D18/Y6/PFN-Br和 D18/Y6/PDIN的混合物的细胞毒性，这些材料用作有机太阳能电池时具有高性能。将人视网膜色素上皮（RPE）细胞系与这些材料直接和间接接触，通过MTT法分析它们的细胞毒性，通过流式细胞术检测细胞凋亡，并通过免疫荧光测定细胞形态和增殖情况。Ahmad Salti等人还通过涂有D18/Y6的微电极阵列（MEAs）评估了小鼠视网膜外植体的电生理记录。
材料提取物的间接细胞毒性和细胞凋亡试验表明，D18、Y6、PFN-Br、喹吖啶酮、D18/Y6/PFN-Br和D18/Y6对人RPE细胞是安全的。然而，对于PDIN，在提取物和直接接触RPE细胞时观察到细胞毒性作用，细胞存活率低于70%。对于直接接触测试，在评估细胞毒性、细胞凋亡、形态学和增殖时，D18、Y6和D18/Y6与对照组相比没有显著差异。当PFN-Br与D18和Y6混合时，在与RPE细胞直接和间接接触10天后会发生强烈的细胞毒性作用。与离体小鼠视网膜接触的D18/Y6涂层MEAs在一小时的记录中显示出恒定的自发放电率。
体外细胞毒性试验为D18/Y6有机半导体对人RPE细胞和小鼠视网膜的安全性提供了证据。该研究还证实PDIN和PFN-Br不适合人类RPE细胞存活。但需要注意的是，这些结论还应辅以体内生物相容性试验，以确保这些材料用于长期视网膜植入的安全性。

小结

维甲酸信号、基因治疗以及视网膜假体等前沿研究为感光细胞变性导致视力丧失的患者带来了光明希望，相信随着研究的不断深入，未来会有更多的治疗新方法和新方向出现。

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