编者按：糖尿病视网膜病变（DR）是工作人群中主要的致盲眼病之一。世界瞩目的WESDR(美国威斯康星DR流行病学研究)中，病程大于15年的患者中，97%的Ⅰ型糖尿病患者、80%使用胰岛素的Ⅱ型糖尿病患者、55%未使用胰岛素的Ⅱ型糖尿病患者均伴有视网膜病变。虽然全球的科学家们对DR开展了广泛的研究，但是DR发病机理仍未完全阐明。在第二十三届中国眼底病论坛暨国际视网膜研讨会（Retina China 2022）上，国家眼部疾病临床研究中心、上海交通大学附属第一人民医院张敬法教授分享了其团队从促红细胞生成素（EPO）作为神经保护/神经营养因子干预或治疗DR的研究到探索小胶质细胞在DR中的作用及阐明EPO调理小胶质细胞作用机理的研究，引入糖尿病视网膜病变转化医学研究新思考，为拓宽DR发病机理及发展细胞调控疗法提出新理念。
糖尿病视网膜病变发病机制
糖尿病是日益严重的全球健康问题，患病人数逐年递增，我国糖尿病患病人数多，治疗相对不足、并发症多。DR是工作年龄人群视力损害和致盲的主要原因，糖尿病黄斑水肿（DME）是DR患者视力受损的主要原因。国际糖尿病联盟（IDF）2019年统计数据显示，DME患病率：非洲7.5%；欧洲11%；每14位糖尿病患者中，就有1位发生DME（7.1%）；全球DME患者约2100万，中国预计826万；20%（1型）及25%（2型）糖尿病患者发生DME。
DR病理生理非常复杂，包含了视网膜微血管病变，即早期血管内皮细胞和周细胞凋亡、血-视网膜屏障破坏等，晚期视网膜新生血管的生成等；也包括了视网膜神经元退行性病变和胶质细胞功能失常，即随着病变进展视网膜神经元逐渐凋亡、视功能逐渐丧失，视网膜内胶质细胞活化，出现胶质化反应。从根本上讲，DR发病过程中，视网膜内所有种类的细胞均被累及（图1）。
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图1 糖尿病视网膜病变及DME发病机制
EPO治疗DR的转化医学研究思路
EPO是一种含有165个氨基酸、34kD的糖蛋白，其抑制红细胞凋亡、促进红系祖细胞增殖和分化，是造血的主要调节因子。EPO最初在肝脏产生，出生后则主要由肾脏间质成纤维细胞产生并分泌，具有神经营养、神经保护、抗炎、抗凋亡等作用，可在多器官、组织中表达并发挥保护作用。临床观察发现EPO治疗糖尿病贫血患者，其视力及眼底症状可得到改善。既往文献也有相关EPO治疗DR及作用机理的研究（图2）。从临床现象的观察，提出了研究假设，然后进行实验室验证，再推广到临床实验研究，最后深入到机制探讨，这是EPO治疗DR的转化医学研究新的思路。
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图2 EPO治疗DR及作用机理的研究
EPO作为神经保护/神经营养因子干预或治疗DR的研究
在过去几年中，张教授团队就EPO作为神经保护/神经营养因子干预或治疗DR开展了广泛的研究，包括药效学、药代动力学和毒理学、安全性、IIT研究、机制研究及基因治疗。首次在糖尿病大鼠模型上证实了眼内注射EPO能有效地保护视网膜神经元、微血管内皮细胞、视网膜色素上皮细胞及血-视网膜屏障，从而预防DR的发生、干预其进展，该研究在国际上率先提出了EPO对DR具有防治作用，可以通过保护视网膜多种细胞控制DR发生，开辟了DR治疗研究新方向(Zhang J, et al, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008;49(2):732-742)。研究得到了该期杂志的重点推荐（Highlight）。论文发表后，受到该领域的广泛关注，研究结果也得到其他学者的证实。
在证明EPO眼内用药的安全性后，张教授团队与美国费城两所医院的眼科进行合作，通过伦理审查及获得患者知情同意的前提下，对部分经当前所有治疗方法均无效的晚期DR患者（难治性、弥漫性DME）进行了EPO眼内注射治疗，临床观察显示EPO治疗后，患者黄斑水肿显著消退，视力提高明显；个别患者经过眼内注射EPO治疗后，患者黄斑区附近硬性渗出斑块逐渐缩小、甚至消失（图3）。
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图3 糖尿病患者眼内注射EPO后，视网膜黄斑水肿消退显著、硬性渗出斑缩小明显（图片节选自Ophthalmic Surg Lasers Imaging 2010; 41: 18-25）。(A)糖尿病患者治疗前OCT检查显示视网膜黄斑区水肿明显；（B）患者治疗后，OCT检查显示黄斑区水肿显著消退；（C）糖尿病患者治疗前视网膜眼底照片显示黄斑区及视乳头周围的硬性渗出；（D）眼内注射EPO后，硬性渗出斑块显著缩小。
EPO治疗DR作用机理的研究
小胶质细胞的活化已被公认为DR神经病理学的重要标志。在糖尿病大鼠模型中，小胶质细胞的形态改变早于视网膜神经元的凋亡和其他胶质细胞的变化。临床现象提示活化的小胶质细胞可能参与或促进视网膜神经元损伤以及血-视网膜屏障的破坏。在临床治疗中，张教授团队观察到视网膜黄斑水肿的消退及硬性渗出斑块的减小，推测可能是由于EPO调控小胶质细胞来发挥作用，即减少炎性因子的分泌，保护BRB屏障并动员小胶质细胞吞噬和清除视网膜内硬性渗出等。该研究有助于深入挖掘糖网状态下小胶质细胞激活的特异性的信号转导通路并制定靶向干预治疗策略，为治疗DR，尤其是中早期DR，提供新的治疗思路。其研究注药包含几个方面：
（1）EPO调控视网膜小胶质细胞的活化及吞噬功能。建立糖尿病大鼠模型，采用冰冻切片和视网膜铺片、免疫荧光、Western blot等方法观察小胶质细胞的活化和吞噬功能，评价EPO对小胶质细胞的调控作用。
（2）EPO调控小胶质细胞炎性因子分泌。采用ELISA法检测糖尿病大鼠视网膜内炎性因子（如VEGF、IL-1、IL-6、IFN-γ、TNF-α等）的表达水平，评价EPO治疗对小胶质细胞分泌炎性因子的调控，并采用实时定量PCR、Western blot、免疫组化等方法验证。同时，采用sEPOR或EPOR siRNA/shRNA阻断EPO作用，观察小胶质细胞的炎性因子分泌情况。
（3）EPO对小胶质细胞调控作用的体外验证。在明确EPO调控糖尿病大鼠视网膜小胶质细胞的效果后，建立体外模型验证EPO对小胶质细胞的调控效果。分离大鼠视网膜小胶质细胞，采用高糖培养基或晚期糖基化终末产物（AGEs）刺激小胶质细胞，研究小胶质细胞活化、炎性因子分泌及EPO的调控效果；将微米级荧光微球加入培养基中，研究小胶质细胞的吞噬功能及EPO的调控效果。
（4）EPO调控DR中小胶质细胞的分子机制。EPO/EPO受体主要通过PI3K/AKT、ERK等信号转导通路发挥保护作用。因此，采集样品后，可利用蛋白磷酸化抗体芯片（如ERK蛋白抗体芯片）筛选、通过标准化及组间比较，找出磷酸化水平变化显著的蛋白作为研究的靶蛋白并建立靶向小分子数据库。针对几个靶蛋白进行干预治疗，为筛选并研发特异性针对视网膜内小胶质细胞的小分子药物做准备。
未来研究方向的延伸和开展
谈及未来研究方向的延伸和开展，张教授提出了以下方向：DR潜在干预靶点筛选及验证；DR发病机制研究及创新治疗；血-视网膜屏障破坏在DME中的作用；视网膜细胞排水功能障碍及细胞性水肿在DME中的作用及治疗；视网膜小胶质细胞细胞功能失调导致DME的机制及治疗；可调控性表达基因治疗DR；并与临床结合，探讨抗VEGF药物联合其他药物（如神经保护、抑制炎症）治疗DME的新思路。
总结
当前，国内外科学家对DR治疗研究的重点多集中在对视网膜神经元和血管的治疗，而针对调控小胶质细胞的治疗较少。张教授团队从EPO治疗DR的临床现象出发，探索了EPO作为神经保护/神经营养因子干预或治疗DR，进一步将研究视角转向小胶质细胞调控方面，旨在阐明DR状态下小胶质细胞的活化及EPO的调控作用，藉此发现EPO调控小胶质细胞的关键信号转导通路或靶蛋白，并建立靶向小分子药物数据库，从而达到“通过调控小胶质细胞治疗DR”的目的。从临床现象的观察，提出了研究假设，然后进行实验室验证，再推广到临床实验研究，最后深入到机制深入探讨，提出了EPO治疗DR的转化医学研究新的思路。
专家简介
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张敬法 教授
上海市眼科研究所副所长。研究员，副主任医师，博士研究生导师，哈佛大学医学院博士后，上海市浦江人才。中国医师协会眼科医师分会第五届委员会基础研究与临床转化副主任委员（兼秘书）、中国老年医学学会眼科分会青年委员会副主任委员、上海市生物医药行业协会精准医疗专业委员会常委、上海市医学会眼科分会视觉研究学组组长等。临床及科研方向为眼底病发病机制及治疗，聚焦糖尿病视网膜病变和年龄相关性黄斑变性。
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Linda Gareth
2015年3月6日, 下午2:51Donec ipsum diam, pretium maecenas mollis dapibus risus. Nullam tindun pulvinar at interdum eget, suscipit eget felis. Pellentesque est faucibus tincidunt risus id interdum primis orci cubilla gravida.