ARVO开幕，华章开启，从细胞、分子、
基因层面看眼病机制的多样性
Jennifer Lippincott-Schwartz教授
医学博士，霍华德·休斯医学研究所Janelia研究院
Jennifer Lippincott-Schwartz教授在ARVO 2023的开幕式上分享重磅讲题——研究亚细胞结构、动力学和功能的新兴成像技术，介绍了细胞、分子、基因领域的新发展，这也是本次ARVO会上的亮点内容。
应用iPSC治疗遗传性视网膜疾病
大有可为！
Budd Tucker教授
医学博士，美国爱荷华大学眼科和视觉科学系
遗传性视网膜疾病是一组与遗传因素密切相关，以原发性视网膜变性为主要病理改变，以视力和视野等视功能严重受损为主要临床表现的疾病。迄今为止，遗传性视网膜疾病已经鉴定出100多种不同的基因和数千种不同的致病突变，其统一特征是感光细胞死亡。由于视网膜本身几乎没有再生能力，感光细胞的死亡会导致不可逆转的视力丧失。幸运的是，分子遗传学、基因组编辑和干细胞生物学领域的科学进步为此类疾病的治疗带来了曙光。本届ARVO会议Cogan奖的获奖者Budd Tucker教授的团队的工作重点是使用患者来源的iPSC对遗传性视网膜疾病患者进行分子诊断、研究和治疗，探讨如何使用患者来源的iPSC评估新基因变异的致病性、检测基于预防性基因的治疗方法的疗效，以及研发恢复性自体光感受器细胞的替代方法。《国际眼科时讯》记者就此方面内容对Budd Tucker教授进行了独家专访。
▍iPSC应用于遗传性视网膜疾病治疗的优势是什么？
iPSC最大的优势是它能够从预期的患者身上产生（即基因相同），使其在移植后不易发生免疫排斥反应。此外，由于这些细胞是由患者体细胞产生的，因此其不存在通常与使用来自发育中胎儿的干细胞相关的伦理问题。The greatest advantage of the iPSC is their ability to be generated from the patients for whom they are intended (i.e., genetically identical), which makes them less prone to immune rejection following transplantation. In addition, as these cells are generated from somatic patient cells, they are devoid of the ethical concerns that are often associated with use of stem cells that are derived from the developing fetus.
▍iPSC治疗遗传性视网膜疾病的具体原理和过程是怎样的？
要实现自体iPSC介导的光感受器细胞置换，需要进行几个过程。
与胚胎干细胞一样，iPSC是多能干细胞，因此在视网膜下移植之前，必须在体外分化为光感受器细胞，否则它们将自发分化为3个胚胎胚层的细胞，并形成一种被称为“畸胎瘤”的非癌性肿瘤。
为了防止遗传性视网膜疾病患者移植后供体视网膜细胞变性，在分化和移植之前可能需要对患者的iPSC进行基因矫正，为此使用CRISPR介导的基因组编辑。
供体iPSC衍生的光感受器细胞作为团状细胞悬浮液向视网膜下注射后的存活率通常很低。为提高供体细胞的存活率，研究者往往将供体光感受器细胞作为偏振三维视网膜外移植物移植到工程细胞递送支架上。
可移植光感受器细胞移植物的产生、CRISPR校正和视网膜分化过程复杂，需要大约40周时间。因此，可能需要使用机器人平台来并行生产以实现规模扩大，满足临床应用需求。
To enable autologous iPSC mediated photoreceptor cell replacement, several processes are required.Like embryonic stem cells, iPSCs are pluripotent as such must be differentiated into photoreceptor cells in vitro prior to subretinal transplantation. If they are not, they will spontaneously differentiate into cells of all 3 embryonic germ layers and form a non-cancerous tumor known as a teratoma.To prevent degeneration of donor retinal cells following transplantation in patients with inherited retinal degenerative disorders, genetic correction of patient iPSCs will likely be required prior to differentiation and transplantation. To do so CRISPR mediated genome editing is used.Survival of donor iPSC-derived photoreceptor cells following subretinal injection as a bolus cell suspension is often poor. To enhance donor cell survival, donor photoreceptor cells are transplanted on engineered cell delivery scaffolds as polarized 3 dimensional outer retinal grafts.Generation, CRISPR correction, retinal differentiation and production of transplantable photoreceptor cell grafts is complex and takes approximately 40 weeks. As such, scale up will likely require use of robotic platforms to enable parallel production.
该项目遇到并克服的最具挑战性的问题如下：
基因矫正——开发能够在特定患者基础上有效矫正致病基因突变的技术，需要开发与当前良好生产实践兼容的试剂和输送系统。我们率先使用基于CRISPR的基因组编辑和新型微流体转染平台来克服这些挑战。
为了促进iPSC衍生的光感受器细胞在移植后的存活，需要开发新型聚合物材料、高分辨率制造技术，并在大型疾病动物模型中进行测试。这一问题通过产生功能化PCL、使用双光子光刻和视紫红质相关RP的猪模型来克服。
为了能够同时生产用于治疗多个患者的视网膜移植物，需要并行生产。但使用手工方式实现这一目标太具有挑战性了，为此团队一直在开发机器人/自动化平台，旨在提高效率，扩大生产规模。
The most challenging aspect of this program that were encountered and overcome were as follows:Genetic correction – Developing techniques to enable efficient correction of disease-causing genetic mutations on a patient specific basis required development of reagents and delivery systems that are compatible with current good manufacturing practices. We have pioneered the use of CRISPR based genome editing and novel microfluidic transfection platforms to overcome these challenges.Biocompatible cell delivery scaffolds to promote iPSC-derived photoreceptor cell survival following transplantation required development of novel polymer materials, high resolution fabrication techniques, and testing in large animal models of disease. This was overcome by generation of functionalized PCL, use of two-photon lithography and a pig model of rhodopsin associated RP.To enable simultaneous production of retinal grafts for the treatment of multiple patients, parallel production will be required. This is challenging using manual manufacturing approaches. To do so we have been developing robotic/automated platforms designed to enable scale up.iPSC治疗遗传性视网膜疾病的前景如何？为了向有需要的患者提供这项技术，我们设想开发具有自动化生产能力的小型模块化制造设施，可以对其进行战略定位，使临床级可移植的移植物能够短距离运输到选定的手术地点。为了保持供体光感受器细胞移植物的高活力，我们设想可以使用便携式培养系统将移植物作为活体产品运送到临床应用中心。虽然我们相信我们现在已经掌握了启动1期临床试验所需的临床前安全性和有效性数据（在与美国食品药品监督管理局的讨论中获得），但是为了实现这项技术的大规模生产和广泛实施，需要进一步发展机器人制造能力。To provide this technology to patients in need we envision development of small modular manufacturing facilities with automated production capabilities, which can be strategically positioned to enable shipment of clinical grade transplantable grafts short distances to select surgical sites. To keep donor photoreceptor cell graft viability high, we envision shipping of grafts to clinical sites as live products using portable incubation systems. While we believe we now have the preclinical safety and efficacy data required to initiate a phase 1 clinical trial (obtained in discussion with the FDA). To enable large scale production and widespread implementation of this technology, further development of robotic manufacturing capabilities will be required.
小结：分子遗传学、基因组编辑和干细胞生物学领域的科学进步为难治性眼病的治疗提供了新的治疗思路，相信随着相关研究的不断深入，未来一定会有更多难治性眼病患者能够重见光明！
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条评论
Linda Gareth
2015年3月6日, 下午2:51Donec ipsum diam, pretium maecenas mollis dapibus risus. Nullam tindun pulvinar at interdum eget, suscipit eget felis. Pellentesque est faucibus tincidunt risus id interdum primis orci cubilla gravida.