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Cell：利用CRISPR-CasRx将Muller细胞转化为神经细胞

2020-04-16 14:21:00
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最近的体外研究表明，下调编码RNA结合蛋白的一个基因 (polypyrimidine tract-binding protein 1, Ptbp1)的表达可以将培养的小鼠成纤维细胞和N2a细胞转化为功能神经元。然而，目前尚无在活体内通过下调Ptbp1研究神经元转换的研究。最近一个被称为Cas13具有RNA向导和RNA靶向特点的CRISPR蛋白为RNA转录的操作提供了一种有效的方法。其中在Cas13蛋白中，一个同源蛋白CRISPR-Cas13d (CasRx)具有最小的尺寸和较高的靶向特异性和效率，是体内治疗的理想选择。为了探索能否利用CasRx特异性地在视网膜中下调Ptbp1基因的表达，实现视网膜神经节细胞的再生，并恢复视网膜损伤小鼠模型的视力。同时，探索能否将纹状体内的星形胶质细胞转化成多巴胺神经元，并且改善帕金森疾病的症状。为此中国科学院神经科学研究所的杨辉，周海波团队对此进行了研究，相关文章 “Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice”于4月8号在线发表在Cell杂志上。

图1. 实验流程图。上图：CasRx通过靶向的降解Ptbp1 mRNA从而实现Ptbp1基因表达的下调。中图：视网膜下注射AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1可以特异性的将视网膜Muller细胞转化为视网膜神经节细胞，转化而来的神经节细胞可以和对应的脑区建立功能性的联系，并且提高视网膜损伤小鼠模型的视力。下图：在纹状体中注射AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1可以特异性的将星形胶质细胞转化为多巴胺神经元，从而消除帕金森疾病小鼠模型的运动功能障碍。

利用CasRx在体外特异性敲低Ptbp1

研究者首先在N2a细胞和星形胶质细胞中筛选了6个能够敲低Ptbp1表达的gRNAs，以了解它们在CasRx编辑Ptbp1中的效率（图2A和B）。经过载体的共转染发现gRNAs 5和6（87% ± 0.4%和76% ± 4%）在下调Ptbp1表达上效率最高（图2C和D）。转录组分析显示，转染2天后，Ptbp1表达特异性下调，而典型神经元基因的转录水平保持不变（图2E和F）。

Ptbp1基因敲低可将成熟视网膜的MG转化为RGCs

为了明确和标记视网膜MG，研究者将AAV-GFAP-GFP-Cre注射到Ai9小鼠(Rosa-CAG-LSL-tdTomato-WPRE)的眼睛中，诱导tdTomato在MGs中特异性表达。在GFAP启动子的驱动下，构建了靶向MG并敲低Ptbp1的AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1 (gRNAs 5+6)，以及不含Ptbp1 gRNAs的AAV-GFAP-CasRx作为对照（图3A）。在Ai9小鼠视网膜下分别注射AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1和AAV-GFAP-CasRx的1个月后，发现视网膜神经节细胞层(GCL)中有许多tdTomato+细胞能进行RGC标记物（Brn3a或Rbpms）的免疫共染色，但是注射对照AAV载体的视网膜中却没有这样的细胞（图3B-E），这个提示在成熟视网膜中MG能转化为RGCs。并且发现MG能转变成不同亚型的RGCs。该结果也在C57BL/6J小鼠中得到重复验证。以上结果表明，RGCs可以通过在成熟视网膜上敲低Ptbp1有效地将MG转化为RGCs。同时还发现除了RGCs，MG还可以通过敲低Ptbp1转变成无长突细胞。

NMDA诱导的视网膜损伤小鼠模型中MG到RGC的转化

为了探索MG起源的RGCs是否能补充视网膜损伤小鼠模型中的RGCs，研究者在4-8周龄的Ai9小鼠玻璃体腔中注射N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA，200mM）,而NMDA能导致RGCs几乎完全丧失，内丛状层（IPL）厚度减少。在NMDA注射2-3周后，在小鼠模型眼内注射AAV-GFAP-CasRx- Ptbp1和AAV-GFAP-GFP-Cre或者对照AAV和AAV-GFAP-GFP-Cre（图4A和B）。在AAV注射1个月后发现GCL中的Brn3a+或者Rbpms+细胞在注射AAV-GFAP-CasRx- Ptbp1小鼠中明显多于注射对照AAV的小鼠，其中大部分的细胞为tdTomato+（图4C-F）。此外在GCL中，超过一半的tdTomato+细胞均表达Brn3a和Rbpms（图4C-F）。为了确定来源于MG的RGCs是否整合到视网膜循环中，是否具有接收视觉信息的能力，研究者在双光子显微镜下对来源于MG的RGCs进行细胞贴附记录，以监测光刺激诱发的反应（图4G）。发现8个细胞中有6个在光刺激下表现出动作电位(图4H)。在这些细胞中，5个为ON细胞，1个为OFF细胞(图4H)。这些结果表明，在损伤的视网膜中可以通过敲低Ptbp1将MG转化为功能性的RGCs。

转化的RGCs中央区投射恢复视觉反应

在视觉系统中，视觉信息通过RGC投射传递到大脑的背外侧膝状核(dLGN)和上丘(SC)（图5A）。在CasRx治疗过的NMDA损伤的视网膜上，观察到在视网膜和视神经上有大量tdTomato+的轴突，而在对照组中则没有这种轴突（图5B和C）。值得注意的是，tdTomato+轴突存在于dLGN和SC中，相对于大脑同侧部，tdTomato+轴突在对侧的含量要丰富得多(图5D和E)。

在AAVs注射后1个月，在小鼠的初级视觉皮层(V1)记录视觉诱发电位(VEPs)(图5F)。AAV-GFPA-CasRx-Ptbp1和AAV- GFAP - mCherry处理的NMDA损伤小鼠的对侧视网膜在受到刺激后诱发出了显著的VEPs，与野生型未损伤小鼠相似，而对照组注射AAV载体的NMDA损伤小鼠仅观察到微弱的反应（图5G和H）。最后，研究者探讨了CasRx介导的MG向RGCs的转化是否能够恢复NMDA诱导的视网膜损伤所丢失的视觉依赖行为（图5I）。研究发现在光/暗偏好测试中，在小鼠双侧玻璃体内注射NMDA可以缩短小鼠在暗环境中停留的时间，这与视网膜损伤导致的视力丧失是一致的。相比之下，在进行过CasRx介导的MG到RGC转化的双侧视网膜损伤小鼠中，其在暗环境的时间明显增加，接近视网膜未损伤小鼠的水平（图5J），这说明视觉依赖行为的恢复。

而MG到RGC的转化在正常小鼠中也是存在的，研究者在AAV注射后的不同时间点（1周，1.5周，2周，3周，1个月）进行了染色以确定MG转化为RGC的过程。发现tdTomato+轴突在视觉通路中逐渐增多:1周时在视神经中未发现标记的轴突(图6A)，而在AAV注射后1.5周时，对侧dLGN中开始出现标记轴突(图6B)。标记首先出现在对侧，但未出现在同侧，SC在2周时出现（图6C），对侧和同侧dLGN和SC在3周时明显出现，在1个月时进一步增加（图6B-D）。而在NMDA损伤的小鼠中也发现相似的结果。

CasRx诱导小鼠纹状体神经元转化

在野生型小鼠纹状体中注入AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1 (gRNAs 5+6)用以下调Ptbp1，同时注入AAV-GFAP-mCherry用以荧光标记星形胶质细胞。同时注入不含Ptbp1 gRNAs的AAV-GFAP-CasRx作为对照。发现mCherry和CasRx在星形胶质细胞中大量表达，并在纹状体中表现出较高的共转染效率。Ptbp1在星形胶质细胞中的表达在注射1周后下降，在AAV注射后1个月，高比例（48% ± 10%）的mCherry+细胞表达成熟神经元的标记物（NeuN），而在对照中则没有。多巴胺神经元标记物酪氨酸羟化酶(TH)与NeuN共染色显示，部分(7.5%±3%) mCherry+细胞表达TH，但NeuN含量较低。

在PD小鼠模型中诱导的神经元具有多巴胺特点

为了探讨CasRx介导的纹状体神经元重编程在体内的潜在作用，研究者通过使用单测输注6-羟基多巴胺(6-OHDA)到右内侧前脑束而产生帕金森(PD)小鼠模型。这种输注会导致同侧腹中脑多巴胺神经元的丢失和同侧纹状体多巴胺能投射的退化。在6-OHDA输注3周后，将AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1(或作为对照的AAV-GFAP-CasRx)与AAV-GFAP-mCherry一起注射到同侧纹状体中。在AAV注射后不同时间点进行纹状体细胞类型分析（图7A和B）。发现注射AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1和AAV-GFAP-mCherry的6-OHDA损伤小鼠，在注射后1个月，表达TH和mCherry的细胞比例均较高，3个月时细胞比例升高（图7C和D）。而在对照组中却很少见（图7C和D）。此外，在病毒注入区，约80%的TH+细胞为mCherry+ (图7E)，表明它们主要来源于星形胶质细胞。继续检测诱导的神经元是否表达成熟的多巴胺神经元标记物Slc6a3 (DAT)，该标记物存在于中脑多巴胺神经元中。发现在AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1组中mCherry+DAT+细胞比例较高（10%±3%，1个月时；31%±7%，3个月时），而对照组中则不存在（图7C和F）。进一步对TH和DAT进行免疫共染色，发现大部分mCherry+TH+细胞表达DAT(图7C, 7G)，表明大多数诱导的神经元表达成熟的多巴胺能标记物。此外，mCherry+细胞表达了另外两种中脑多巴胺神经元标记物（DDC和FOXA2），进一步表明了转化的神经元具有多巴胺能特征。

为了探索诱导神经元的亚型，用两个黑质致密部(SNc)A9区域特异性多巴胺神经元标记物(ALDH1A1和GIRK2)对TH进行共染色，用腹侧被盖区(VTA)特异性多巴胺神经元标记物calbindin对DAT进行共染色。结果显示几乎所有的诱导神经元都表达了ALDH1A1和GIRK2，但不表达calbindin（图7H-J）。提示诱导的神经元具有许多SNc多巴胺神经元的特征。

对注射的小鼠纹状体切片进行全细胞记录，发现大多数神经元样mCherry+细胞(22个细胞中有20个)对去极化电流注射反应能够产生重复动作电位（图7K）。另外转换后的神经元能够接受功能性的突触输入（图7L和M）。此外，在4个（4/10）神经元的检查中，观察到了延迟整流电压现象（图7K）。另外还发现大多数mCherry+TH+细胞表达一种调节多巴胺包装、储存和释放的重要蛋白（VMAT2）(图7N)。同时病毒注射区域很多转化后的细胞具有多巴胺释放功能（图7O-Q）。基于以上结果表明，CasRx介导的Ptbp1敲低可以有效诱导PD模型小鼠纹状体中具有多巴胺能神经元特征的神经元形成。

诱导的神经元可减轻PD小鼠的运动功能障碍

研究者进一步研究了在6-OHDA诱导的PD小鼠模型中，纹状体诱导的神经元是否可以缓解PD症状（图8A）。发现用阿朴吗啡诱发的旋转实验在AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1组中明显减少，与无损伤的野生型小鼠水平相当（图8B）。而另一种由全身使用苯丙胺诱导的同侧优先旋转行为在AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1组中也明显减少（图8C和D）。分别用圆柱形试验和旋转棒试验检查了两种非药物性运动功能障碍。发现与对照组小鼠相比，注射了AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1的小鼠，其同侧圆柱体的接触百分比明显较低，且其在旋转棒上的停留时间更长（图8E和F）。以上结果说明敲低Ptbp1而诱导的神经元可以减少PD小鼠模型的运动功能障碍。

综上所述，CasRx介导的Ptbp1敲低引起的胶质神经元转换是一种有前景的遗传学治疗方法，可用于治疗由于神经元丢失而引起的各种疾病。

参考文献：Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice. Cell. 2020 April 08

点评

邹绚

北京协和医院

视网膜神经节细胞(RGCs)是视网膜唯一的输出神经元，它的退化所导致的永久性失明是视网膜疾病的重要原因。Muller神经胶质（MG）向RGCs的转分化被认为是一种潜在的恢复视觉功能的治疗方法。但是，MG在小鼠出生后2周左右丧失神经源性能力，MG到RGCs的转化在成熟哺乳动物视网膜中尚未实现。中国的生物医学科研能力近年来有了长足进步。最近中科院神经研究所杨辉课题组的研究工作，利用CRISPR-CasRx RNA编辑系统在小鼠体内敲降PTBP1后，实现了将视网膜上的Muller神经胶质细胞直接转分化为RGCs，并缓解由于RGC缺失导致的视力损失；他们还利用相同的方法在帕金森小鼠模型上实现了纹状体原位多巴胺神经元再生，并缓解了小鼠运动功能失常，证明了PTBP1敲降介导的神经细胞重编程技术在再生医学上的应用，并展现了CRISPR-CasRx RNA编辑系统在神经相关退行性病变应用中的潜力。这是一项非常具有科学价值的工作，为未来众多神经退行性疾病，包括眼科多种视网膜视神经疾病的治疗提供了非常有前景的方案。