编者按：腺相关病毒（AAV）因其安全性、长期表达能力和视网膜靶向性，成为眼科基因治疗的核心载体。然而，其临床应用仍面临多重挑战，涉及免疫反应、转导效率、载体设计、给药途径及生产瓶颈等多个层面。在ARVO 2025会议上，以"Imagining 、Innovation and Intelligence"为指导，涌现出很多创新的AAV载体优化方法，显著提升了AAV转导效率，让我们一睹为快。

核心内容提要

1.MC1衣壳修饰可显著提升AAV通过玻璃体内注射在小鼠、犬和NHP视网膜中的转导效率。

2.定向进化筛选新型AAV变体，是发现高效RPE转导变体的可行方案。

3.机器学习指导的衣壳设计与高通量单细胞筛选平台，有助于开发出性能优于天然存在、临床阶段及工程化AAV载体。

通过修饰AAV的VP1u结构域，可显著改善玻璃体内注射对小鼠、犬和非人灵长类视网膜的转导效率

腺相关病毒（AAV）载体具有宿主范围广、安全性高、免疫原性低、表达稳定和物理性质稳定等优点，是基因治疗的首选工具，尤其在视网膜疾病的基因治疗中具有显著的应用潜力。然而，转导效率低和剂量相关的副作用限制了其在眼病中的广泛应用。为了克服这些挑战，研究人员开发了多种方法来优化AAV载体的性能，包括衣壳修饰技术。在此研究中，研究人员开发了一种名为MC1的新型衣壳修饰方法，旨在测试其能否提高AAV在小鼠、犬和非人灵长类（NHP）视网膜中的转导效率。

MC1修饰是基于AAV VP1u衣壳结构域的残基突变设计的，并将其移植到两种视网膜靶向性衣壳AAV2和AAV2.7m8（7m8）上。重组产生的AAV2.MC1和7m8.MC1衣壳包装了由CB6泛表达启动子驱动的Egfp报告基因。通过玻璃体内注射（IVT）在小鼠、犬和食蟹猴中测试载体效果，通过眼底成像、视网膜组织ddPCR和免疫荧光染色评估转导效率，定量分析AAV2、7m8及其MC1修饰版本的转导差异。研究还评估了AAV2.MC1递送抗VEGF基因（KH902）治疗小鼠湿性年龄相关性黄斑变性（wAMD）的效果。通过激光损伤诱导脉络膜新生血管（CNV），损伤后5天注射7m8、AAV2和AAV2.MC1载体，观察35天内CNV病灶的变化以评估病理逆转效果。

结果显示，AAV2和7m8经MC1修饰后，分别在小鼠视网膜中的转导效率提高了4倍和3倍（n=10眼，P≤0.001）。AAV2.MC1在犬视网膜中的转导效果优于7m8（n=2眼）。在单例非人灵长类实验中，AAV2.MC1的EGFP分布比AAV2更广且更稳定。冰冻切片显示，MC1修饰增强了载体穿透能力，在所有动物模型中均实现了外视网膜层的有效转导。AAV2.MC1.KH902对CNV病灶的逆转效果优于AAV2.KH902和7m8.KH902（分别提高2倍和1.5倍，n=5-7眼）。

结论

该研究证明MC1衣壳修饰可显著提升AAV通过玻璃体内注射在小鼠、犬和NHP视网膜中的转导效率，并为改善wAMD基因治疗载体疗效提供了概念验证。目前正在评估MC1修饰衣壳在其他应用中的潜力，如青光眼等其他眼科疾病中的应用前景。未来，随着技术的进一步优化和临床试验的推进，该技术有望为多种眼科疾病的基因治疗提供更高效、更安全的解决方案。

标题：Modifying the VP1u Domain of AAV Improves Transduction of Murine, Canine, and Non-Human Primate Retinas by Intravitreal Injection

摘要编号: 4652

作者：Mengtian Cui, Shun-Yun cheng, Bo Tian, Christine Harman, Amanda Jacobson, Lydia E. Kapeller,Melaney A. Mayes, Jackson McGowan, Haijiang Lin, Allison M. Keeler, Andras M. Komaromy, Meredith S.Gregory-Ksander, Ann Marshak-Rothstein, Claudio Punzo, Phillip Tai, Guangping Gao

通过定向进化筛选发现新型AAV变体，实现玻璃体内注射高效转导视网膜色素上皮

腺相关病毒（AAV）介导的基因疗法需靶向退行性视网膜疾病的起源部位——外层视网膜。目前，视网膜下注射可实现高效外层视网膜转导，但可能导致与疾病危害相当的医源性损伤。为此，我们通过合成并筛选AAV变体库，发现了一种新型AAV变体，可通过创伤更小的玻璃体内注射（IVT）高效转导视网膜色素上皮（RPE）。目前尚不明确AAV需具备何种特性才能通过玻璃体转染RPE细胞，因此研究进行了高通量AAV衣壳筛选：

AAV2-7肽插入文库：设计包含1.48×109种插入AAV2衣壳外部的7肽变体，以改变衣壳结合特性。

AAV2-表面环序列替换文库：构建4.10×1014种外表面环序列变体，进一步优化衣壳结合功能。

通过玻璃体内注射筛选文库，淘汰无效变体，对潜在候选变体进行浓度梯度复筛，最终锁定高效转导RPE的变体。

在食蟹猴、犬和小鼠中筛选AAV2-7肽文库，在犬中筛选AAV2-表面环替换文库。通过二代测序量化变体在眼后段或RPE细胞的富集度。将表现最佳的变体包装由泛在启动子CAG或RPE特异性启动子VMD2驱动的GFP报告基因，发现变体#3的RPE转导效率显著优于对照（7m8）。变体#3的RPE转导效率平均比7m8高5倍（n=14）。7m8（源自AAV2-7肽文库）虽可转导外层视网膜神经元，但几乎无法转导RPE细胞。

结论

定向进化筛选AAV变体库是发现高效RPE转导变体的可行方案，此类变体可作为Leber先天性黑蒙2型（LCA2）等RPE相关视网膜疾病的治疗载体。近期FDA批准的首个干性年龄相关性黄斑变性（AMD）及地图样萎缩（GA）药物SYFOVRETM需每25—60天玻璃体内注射一次，而AAV疗法单次注射可持续数年。Leber先天性黑蒙2型（LCA2）由RPE细胞中Rpe65基因突变引起，导致11-反式视黄醛无法恢复为11-顺式视黄醛参与光转导，致使患者出生后6个月即因光感受器失活致盲。针对此类RPE突变疾病，需找到既能靶向RPE细胞又避免黄斑脱离的AAV载体。目前尚未见通过优选给药途径（IVT）实现高效RPE转染的公开证据。本研究鉴定出一例有潜力的IVT转染RPE候选变体，并通过定量实验证明其效果显著优于已知外层视网膜转染衣壳7m8。

标题：Discovering A Novel AAV Variant for Efficient RPE Transfection via Intravitreal Injection for Retinal Degenerative Disease

摘要编号: 4653

作者：Sonali Singh, Meike Visel, Aneal Singh, Leah Byrne, Catherine Bowes Rickman, John Gerard Flannery

革新玻璃体内基因治疗：基于机器学习指导的高复杂度AAV衣壳文库设计与scAAVengr-HUnT平台的整合

遗传性视网膜退行性疾病是由超过280种基因突变引发的一组异质性致盲疾病。基因治疗有望通过纠正这些突变改善患者生活质量，但如何实现有效递送仍是视网膜基因治疗成功的关键挑战。本研究构建了一系列针对玻璃体注射优化的高性能腺相关病毒（AAV）载体，并应用创新机器学习方法进一步提升AAV载体递送效能。

平台开发：构建 scAAVengr-HUnT（单细胞AAV工程高通量无偏筛选平台），用于优化视网膜基因治疗载体。

文库构建：在AAV衣壳可变区插入6肽序列，生成带条形码的高复杂度AAV文库。

筛选流程：

1)将文库通过玻璃体内注射（IVT）递送至成年食蟹猴眼内；

2)通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）定量条形码mRNA转录本，筛选高效转导变体；

3)在独立实验中验证候选变体：以临床相关剂量递送携带GFP报告基因的单个衣壳，通过单细胞分析和共聚焦成像评估转导效率及视网膜细胞靶向性。
结果显示，筛选出的AAV变体转导效率显著提升；变体可同时转导视网膜中央区、周边区及全视网膜细胞类型；最优全视网膜载体性能超越亲本血清型及临床阶段工程化AAV（如Luxturna™所用AAV2）；与现有临床载体相比，转导范围更广、细胞靶向性更强。能在全视网膜实现转基因表达，并精准靶向不同视网膜区域和细胞类型。在规避免疫检测的临床低剂量水平下，最优变体成功递送与X连锁视网膜劈裂症（XLRS）相关的RS1基因，彰显其治疗潜力。

结论

本研究通过整合机器学习指导的衣壳设计与高通量单细胞筛选平台，开发出性能优于天然存在、临床阶段及工程化AAV载体。其全视网膜转导能力和低剂量有效性为遗传性视网膜疾病的基因治疗提供了新策略，有望推动患者护理水平的提升。

标题：Revolutionizing intravitreal gene therapy: Integrating machine learning-guided design of high-complexity AAV capsid libraries with the scAAVengr-HUnT platform

摘要编号: 4651

作者：Laura Campello, Molly Johnson, Bilge Esin Öztürk,Morgan Sedorovitz, Maryl Lambros, Emre Sevgen,Hannah Schriever, Brett Hogle, Megan Gillespie, Jane Hartung, Janis Koester, Inga Clausen, Megana Prasad, Nora Denk, Helene Haegel, Barbara Lenz, Florian Neff, Stefan Seeber, Miguel Betegon, Paul A.Sieving, Jose Alain Sahel, Sascha Fauser, Rob Lin, Jacek Krol, Leah Byrne

总结

AAV在眼科基因治疗中的挑战核心在于如何平衡高效转导与安全性。当前研究通过衣壳工程化（如7m8、ShH10）、递送技术革新及生产优化逐步突破瓶颈。未来，结合机器学习预测衣壳-受体互作、开发跨物种稳定启动子，以及探索非病毒载体可能进一步推动眼科基因治疗的临床转化。随着多项临床试验的推进，AAV有望从罕见病扩展至常见视网膜疾病（如干性AMD、青光眼），实现“一针治愈”的愿景。

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