细胞内外多余物质的堆积见于很多年龄相关疾病，包括动脉粥样硬化，阿尔茨海默病以及年龄相关性黄斑变性（AMD）。其中AMD是导致中心视力下降的主要疾病，包括湿性（15%）和干性（85%）两种类型。目前，干性AMD没有有效的治疗方法，特征性的表现为细胞外碎片随着年龄的增长而积累，也就是所谓的drusen。而大的drusen有可能发展为新生血管性AMD。组织学发现drusen存在于RPE和Bruch膜之间。而在RPE下的物质堆积可分类为两种类型：基底线状沉积(BLinDs)和基底薄片样沉积(BLamDs)。而BLamDs是早期AMD中最常见的组织学类型。但是其产生的机制还不是很清楚。
溶酶体相关膜蛋白-2 (LAMP2)是一种相当丰富的溶酶体糖蛋白，它是直接导入溶酶体的蛋白的受体，也是自噬体/吞噬体成熟的中介。在本研究中，研究者研究了LAMP2在视网膜生理学和AMD病理学中的作用。相关研究结果发表在PNAS杂志上。
研究者首先检测了LAMP2在小鼠神经视网膜和RPE/脉络膜中的表达。发现LAMP2蛋白在RPE中的表达明显高于神经视网膜（图1A）。继续将RPE细胞层从年轻和年老的野生型（WT）小鼠中分离出来，发现相比2月龄的小鼠，12月龄小鼠的LAMP2表达更低（图1B）。而且另外一个自噬蛋白SQSTM1在RPE/脉络膜中的表达，在12月龄WT小鼠中也比2月龄的小鼠要明显减少（图1C）。这些提示LAMP2在RPE中起重要作用，且受年龄影响。
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图1. LAMP2在年轻和年老小鼠视网膜中的表达情况
对Lamp2敲除小鼠进行眼底照相和眼底自发荧光（FAF）检查，眼底照相发现在6-12月龄的Lamp2 敲除小鼠中，随着年龄的增长，眼底呈现出斑片状色素。而在同年龄的WT小鼠中没有异常改变（图2A）。而在FAF上能发现Lamp2敲除小鼠眼底有很多点状的高荧光，且随着年龄的增长变多，而在同年龄WT小鼠中不存在（图2B）。用荧光显微镜对小鼠视网膜RPE细胞进行观察发现Lamp2敲除小鼠有很多颗粒状的荧光（图2C）。这些结果表明，在缺乏Lamp2的小鼠RPE中，颗粒状自发荧光的表达增加。
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图2. A. Lamp2敲除小鼠和WT小鼠的眼底照片
B. Lamp2敲除小鼠和WT小鼠眼底的自发荧光
C. Lamp2敲除小鼠和WT小鼠视网膜切片的免疫荧光
继续对Lamp2敲除小鼠进行电镜的观察，发现在Lamp2敲除小鼠视网膜中有BLamDs，且在12月龄中更明显（图3A）。而且超微结构检查发现BLamDs内部有颗粒状电子致密结构（图3A，箭头）。这些颗粒状物质似乎从RPE中逸出，进入细胞外的基底外侧区域。而且在12月龄Lamp2敲除小鼠中观察到脂滴样内容物的积累（图3B，星号）。而油红O染色显示该脂滴存在于Lamp2敲除小鼠的RPE中（图3C）。另外，LAMP2的缺失使Bruch膜随着年龄增加不断增厚（图3D）。增厚的Bruch膜PAS染色阳性，而Lamp2敲除小鼠PAS阳性结构厚度大于WT组（图3E），这与老年人Bruch膜的特征相似。而Lamp2敲除小鼠组织学和功能学的检测也发现RPE功能障碍伴随年龄相关性光感受器丧失。
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图3. LAMP2的缺乏导致脂质的积累、基底层沉积和Bruch膜的增厚
A. Lamp2敲除小鼠和WT小鼠视网膜的TEM B. Lamp2敲除小鼠和WT小鼠视网膜Azure II染色和TEM C. Lamp2敲除小鼠和WT小鼠视网膜的油红O染色 D. Lamp2敲除小鼠和WT小鼠Bruch膜的TEM E. Lamp2敲除小鼠和WT小鼠视网膜的PAS染色
对Lamp2敲除小鼠RPE下的沉积物进行分子学检测。Western blot检测发现人类患者drusen中的关键蛋白（APOE，CLU，VTN）在Lamp2敲除小鼠中均明显升高（图4A）。免疫荧光也证实这些分子在RPE中累积（图4B），并对荧光强度进行定量分析（图4C）。免疫荧光分析还发现，与12月龄的WT小鼠相比，Lamp2敲除小鼠的IV型胶原蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白等细胞外基质蛋白减少（图5）。对Lamp2敲除小鼠眼内的脂类物质改变进行检测，发现APOA1的表达升高，而APOB并没有升高（图5）。非律平细胞染色（Filipin Staining）发现未酯化胆固醇(UC)聚积在Lamp2敲除小鼠的RPE下，而酯化胆固醇（EC）含量也升高（图5）。以上结果均表明Lamp2敲除小鼠中的BLamDs与脂质积累和细胞外基质表达降低有关。
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图4. Lamp2敲除小鼠RPE下沉积物的分析特征
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图5. Lamp2敲除小鼠眼睛细胞外基质蛋白减少和脂类沉积
研究者进一步研究了潜在的细胞和分子机制。透射电镜（TEM）发现2月龄Lamp2敲除小鼠RPE中POS吞噬体的数量增多（图6A）。并且到6月龄时发现，大部分的吞噬体形态变大（图6A，箭头）。对6月龄Lamp2敲除小鼠RPE进行检测发现所有微管相关蛋白1A/1B轻链3蛋白（LC3）表达增加，且含脂与不含脂LC3的比例（LC3-II/I）升高，SQSTM1蛋白表达也升高（图6B），自噬小泡积累增加（图6C）。LC3-II的聚积可能跟自噬紊乱有关，同时SQSTM1的积聚跟自噬减少有关。
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图6. Lamp2敲除小鼠RPE中紊乱的自噬功能
为了进一步研究受损的自噬消化功能是否有助于细胞外沉积的形成，研究者在体外培养小鼠原代RPE细胞，发现相比WT小鼠，Lamp2敲除小鼠的RPE表现出明显的基底外侧沉积（图7）。这些数据表明，POSs的吞噬降解受损和溶酶体胞吐增多使Lamp2敲除小鼠易形成BLamDs。
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图7. 体外培养的缺乏Lamp2的RPE
最后研究者在人类眼中检测LAMP2的表达。LAMP2主要在RPE中检测到，而不是在视网膜中（图8A）。且LAMP2在AMD患者组织中表达较正常人相对降低（图8B和C）。
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图8. AMD患者眼睛RPE中LAMP2表达下降
综上所述，LAMP2主要表达在RPE，其遗传缺陷导致形成RPE下沉积(BLamDs)，蛋白质和脂质的积累，其特征类似于人类AMD的特征。
参考文献：
Notomi S, Ishihara K, Efstathiou NE et al. Genetic LAMP2 deficiency accelerates the age-associated formation of basal laminar deposits in the retina. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019 Nov 19;116(47):23724-23734.
点评
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邹绚
北京协和医院
RPE细胞的主要功能之一是对光感受器外层细胞(POSs)的吞噬作用，这些细胞每天从视网膜光感受器细胞中脱落。而对POSs吞噬功能的消失可能参与了年龄相关的RPE变化，即脂褐素积累。虽然脂褐素与drusen的生物发生机制不同，但可能有部分drusen物质来自POSs，这可能与溶酶体功能有关。而很多动物实验也表明自噬跟RPE功能紊乱有关。因此溶酶体/自噬的通路很可能参与了RPE和AMD的病理生理过程。Lamp2敲除小鼠的特征是肝细胞、神经元和白细胞的自噬和吞噬被破坏。人类LAMP2基因功能缺失突变可导致Danon病（溶酶体存储障碍的疾病，其特征是心肌病、骨骼肌病和智力迟钝），Danon病患者也表现出进行性的视网膜变性，这表明LAMP2可能对视网膜稳态起作用。本研究结果揭示了溶酶体LAMP2在RPE功能、RPE下基底层沉积形成和AMD病理中的作用。这些结果提示LAMP2表达的刺激可能可以作为AMD潜在的干预措施。
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条评论
Linda Gareth
2015年3月6日, 下午2:51Donec ipsum diam, pretium maecenas mollis dapibus risus. Nullam tindun pulvinar at interdum eget, suscipit eget felis. Pellentesque est faucibus tincidunt risus id interdum primis orci cubilla gravida.