ARVO眼肿瘤丨视网膜母细胞瘤基础研究新进展:从分子靶向治疗到基因变异研究

  • 2024-05-09 17:31:00
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按:视网膜母细胞瘤(RB)是儿童眼部恶性肿瘤的一种常见类型,在美国西雅图盛大召开的ARVO 2024年会上,汇集了来自世界各地的眼科专家和学者,分享了一系列关于RB的基础研究成果。这些研究旨在运用最新分子生物学、遗传学技术探索新的治疗方法、揭示肿瘤发生发展机制,并为未来的治疗提供新的方向。


激活MDM4-p53通路治疗RB的新分子靶向疗法

虽然RB是一种常见的儿童眼部肿瘤,其治疗已经得到了改善,但仍有一些亟待解决的问题,如避免治疗相关的副作用,保留视功能,以及预防治疗后的继发性肿瘤。CEP1347是一种小分子激酶抑制剂,可作为多种肿瘤的潜在分子靶向治疗药物。Keita Togashi等人开展了一项研究,旨在确定CEP1347对RB增殖的抑制作用,并阐明潜在的机制,从而探索RB的新治疗方法。

研究采用了6种RB细胞株(Y79、WERI-Rb-1、NCC-RbC-51、NCC-RbC-54、NCC-RbC-60和NCC-RbC-83)进行体外实验,明确CEP1347的抗肿瘤作用。以正常人胚肺成纤维细胞(IMR90)为对照。WST-8法检测细胞活力和生长抑制情况。免疫印迹法检测细胞内蛋白的动态变化。

结果显示,CEP1347在6株RB细胞株中有5株在纳摩尔水平表现出增殖抑制。各浓度的IMR90对细胞增殖均无抑制作用。CEP1347抑制增殖的5株细胞株均表现出P53表达的增加。另一方面,NCC-RbC-51对CEP1347的作用较弱,但CEP1347并没有增加P53的表达。P53的活性受到MDM2 (P53的泛素化)、MDM4(在转录水平抑制P53)或两者的协同抑制。在CEP1347敏感的5株细胞株中,CEP1347抑制MDM4的表达,增强P53的表达;在对CEP1347较不敏感的NCC-RbC-51细胞中,MDM4低表达,CEP1347未增强MDM4表达。P53抑制剂Pifithrin-α可抑制CEP1347诱导的P53表达上调和肿瘤细胞增殖抑制。CEP1347不影响任何细胞中MDM2的表达。研究者认为,CEP1347在纳摩尔水平可特异性抑制MDM4,激活P53,抑制肿瘤细胞增殖。这提示CEP1347有潜力成为RB的一种新型分子疗法。

讲题:Novel Molecularly Targeted Therapy for Retinoblastoma Through Activation of MDM4-p53 Pathway

第一作者:*Keita Togashi

共同作者:Kaneko Yutaka, Hidetoshi Yamashita, Masahiko Sugimoto


CaV3.3通道作为Y79 RB细胞克服卡铂耐药的关键调节因子

此项研究扩展了研究者团队之前的研究成果(Kim 等人,2021 年,Pflugers Arch - Eur J Physiol),该研究发现了人类RB Y79细胞中一小部分较大的 "巨型细胞",以及它们的T型钙通道功能表达。研究者现在的目标是进一步探索这些T型通道,特别是 CaV3.3亚型,以阐明其在这些巨细胞的卡铂耐药机制中的作用。

该研究采用了膜片钳技术,包括电流和电压钳实验,分析Y79细胞的电生理特性。卡铂耐药Y79 (CR-Y79)表型中的“常规”和“巨型细胞”通过K-Means聚类来区分,这是一种基于细胞大小和静息膜电位的无监督分类方法。为了探索与CaV3.3亚型的关系,研究者比较了这些不同细胞群中的钙电流,并使用基因沉默和药理学方法进行了选择性抑制实验。

结果显示,CR-Y79表型中“巨型细胞”的比例显著增加。这些细胞表现出短暂的钙电流,然后是持续的钙电流,而在“常规”细胞中只观察到短暂的电流。初始短暂电流后持续电流的存在与CaV3.3亚型密切相关。此外,研究结果还表明,在CR-Y79细胞中抑制CaV3.3活性显著增加了它们对卡铂的敏感性,强烈表明CaV3.3通道在卡铂耐药的发展中起着关键作用。

研究者认为,CaV3.3在“巨型细胞”中的特异性表达与其对卡铂的耐药性增强有关。虽然需要进一步研究,但这些结果强调了钙通道作为卡铂耐药性RB潜在治疗靶点的重要性。此项研究为进一步研究RB更有效的治疗方法奠定了基础。

讲题:CaV3.3 Channels as Key Modulators for Overcoming Carboplatin Resistance in Y79 Retinoblastoma Cells

第一作者:*Sooyun Kim,

共同作者:Chang Sik Cho, Dong Hyun Jo, Jeong Hun Kim


RB中ALYREF的表达和细胞生长调节

ALYREF/THOC4是一种RNA核转运蛋白,在多种癌症类型中过表达与不良预后相关。然而,关于ALYREF在人RB中的表达、其在肿瘤进展中的可能作用、预后价值和相关性尚不清楚。Gail M. Seigel等人评估了ALYREF在人RB中的表达及其对RB细胞生长和活力的相关影响,以检验以下假设:ALYREF有可能成为RB的药物靶点和预后生物标志物。

该项研究采用免疫组织化学染色、Western Blot和PCR方法检测RB细胞株(Y79、RB143、WERI-RB1和RB116)中ALYREF的表达。使用14个样本的RB肿瘤阵列来确定ALYREF免疫反应性的个体变异。在Y79和WERI-RB1细胞中,使用ALYsi vs. off-target control (OTCsi) siRNA处理48小时来抑制ALYREF的表达。通过WST-1分析siRNA处理的RB细胞的生长和活力,通过PCR分析细胞生长标志物Ki67和PCNA的表达。所有方法均显示ALYREF在RB细胞株和多种RB肿瘤组织中均有表达。在RB肿瘤阵列中,11/14的肿瘤呈现不同程度的ALYREF+,其中8个肿瘤最高达3+。部分邻近“正常”视网膜ALYREF+主要分布于INL和GCL,而部分肿瘤眼的ALYREF+主要分布于视神经。在WERI-RB1和Y79细胞中,用siRNA (ALYsi)敲除ALYREF转录本导致细胞生长下降40%(P<0.05)。随着生长速率的降低,通过ALYsi敲除ALYREF导致细胞增殖标记物Ki67和PCNA的表达降低(P<0.005)。

研究结论为,ALYREF/THOC4在多种RB肿瘤及RB细胞株中均有表达。ALYREF可在肿瘤本身、视神经以及邻近的“正常”视网膜中表达,提示其在视神经侵袭/肿瘤进展中发挥作用。与其他肿瘤一样,这种表达模式可能导致ALYREF成为RB潜在有用的预后指标。在RB细胞系中敲除ALYREF导致细胞生长显著下降,以及细胞增殖标志物Ki67和PCNA的表达下降。这些结果提示了ALYREF在RB细胞生长调节中的作用,以及它作为抗肿瘤疗法抑制肿瘤生长的靶点和生物标志物的潜力。

讲题:ALYREF Expression and Cell Growth Modulation in Retinoblastoma

第一作者:*Gail M. Seigel

共同作者:Onyekwere Onwumere, Moira Sauane, Enyuan Shang, Stephen Redenti, Hans E. Grossniklaus, Rajendra Gharbaran


靶向全外显子测序揭示RB的RB1基因致病性遗传变异的热点

基因检测在确定RB的遗传性质和确定患者及其家庭成员的肿瘤风险方面起着关键作用。Shailja Tibrewal等学者的研究旨在描述印度北部RB患者的基因型情况,并得出基因型-表型的相关性,尤其是与侵袭性疾病相关的基因型。

研究采用回顾性观察性研究方法,纳入2021年1月至2022年12月在某三级甲等眼科医院行基因检测的RB患者。应用全外显子组测序(Whole exome sequencing, WES)技术对患者外周血标本进行RB1基因检测。阴性者采用多重连接探针分析(MLPA)检测RB1基因的缺失/重复。根据发病年龄、疾病严重程度(使用国际RB分类[International Classification of Retinoblastoma]和国际RB分期系统[International Retinoblastoma Staging System])、转移状态、保眼和肿瘤复发确定患者的表型。侵袭性肿瘤定义为发病年龄<12个月、ICRB C到E组和肿瘤复发。遗传变异与表型决定因素相关。

该研究共纳入150例RB患者,其中86例为单眼RB,62例为双眼RB,2例为三侧RB。有RB家族史者11例(7.33%)。75/150例(50%;双侧58例,单侧17例)均为致病性RB1基因变异。WES检出69例(54例双侧,15例单侧),MLPA检出6例(4例双侧,2例单侧)。观察到点突变37例(49.3%),小片段缺失16例(21.33%),重复3例(4%),大片段缺失8例(10.66%),剪接位点变异和启动子甲基化11例(14.66%)。RB1基因的无义变异和缺失是最常观察到的遗传变异,也与侵袭性疾病相关。50%的患者在RB1基因的14-21号外显子间观察到一种独特的遗传变异聚类模式。

研究者认为,RB1基因第14-21外显子是潜在的研究热点。无义变异和缺失与侵袭性疾病相关。一半的病例没有RB1突变,表明了RB复杂的基因组图谱,未来可以通过详细分析肿瘤的体细胞突变谱以助于更好地理解。

讲题:Targeted whole exome sequencing reveals hotspot for pathogenic genetic variations in RB1 gene in retinoblastoma

第一作者:*Shailja Tibrewal

共同作者:Ria Ratna, Akhil Varshney, Sima Das


结:ARVO 2024年会上,多项关于RB的基础研究成果引人关注。研究指出CEP1347对MDM4和P53的调节可能为视网膜母细胞瘤的新型治疗提供方向;CaV3.3通道发现为耐药性治疗提供新思路;ALYREF表达与肿瘤生长相关;RB1基因变异与肿瘤侵袭性相关。这些研究成果为进一步探索RB的发病机制、发展新的治疗策略以及提高患者生存率提供了重要的分子生物学基础。


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条评论

  • Linda Gareth
    2015年3月6日, 下午2:51

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