编者按：新生血管性年龄相关性（老年性）黄斑变性（neovascular age-related macular degeneration, nAMD）以脉络膜或视网膜新生血管（choroidal or retinal neovascularization, CNV or RNV）为特征，占AMD相关视力丧失和失明的90%，最终导致黄斑区纤维化瘢痕的形成。视网膜下纤维化的发生和发展导致患者视力预后不良，目前尚无明确有效的治疗方法。近日，上海交通大学医学院附属第一人民医院眼科张敬法教授团队和同济大学医学院徐国彤教授团队发表了题为“Wnt5a/β-catenin-mediated epithelial-mesenchymal transition: a key driver of subretinal fibrosis in neovascular age-related macular degeneration”的文章，研究发现Wnt5a/β-catenin正反馈环路可通过促进视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium, RPE）的上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）介导nAMD继发视网膜下纤维化的进展。该研究发表在中科院1区SCI期刊Journal of Neuroinflammation上。

研究背景

目前，抗血管内皮生长因子（anti-vascular endothelial growth factor，Anti-VEGF）的玻璃体腔内注射已成为治疗nAMD的首选疗法。该治疗通过抑制脉络膜和视网膜的异常血管生长，从而改善或维持患者的视力。然而，即使接受足够的anti-VEGF治疗，仍有约1/3的患者因患视网膜下纤维化而对anti-VEGF治疗不敏感，进而发展为不可逆的视力损害。大量文献支持RPE通过EMT成为活化的肌成纤维细胞，进而生成大量病理性细胞外基质（extracellular matrix, ECM），ECM的过度沉积在nAMD继发视网膜下纤维化发病机制中发挥关键作用。因此抑制EMT可作为防治视网膜下纤维化的潜在策略之一。

Wnt信号通路包含经典Wnt信号通路和非经典Wnt信号通路，共同控制胚胎发育、维持成人组织稳态和癌症发展。研究表明，持续的Wnt信号激活参与多种组织纤维化（如肝、肾、肺、肌肉、心脏、皮肤、肠道、气管等）和衰老相关疾病。在nAMD中，经典Wnt/β-catenin通路介导的多种视网膜细胞的间质转化过程已被广泛报道可以促进视网膜下纤维化的发生。例如，受TGF-β2刺激的Müller细胞明显上调了TGF-β-Smad2/3信号通路和经典Wnt信号通路，促进了视网膜下纤维化的发生[1]。在人体原代RPE细胞中，过度激活的经典Wnt信号与TGF-β/Smad通路协同促进视网膜下纤维化疾病进展[2]。另外，研究表明非经典Wnt配体Wnt5a在不同组织中的EMT和纤维化过程中具有重要作用，但其触发信号的精确分子机制及其与经典Wnt/β-catenin途径在EMT中的相互作用，以及二者在nAMD继发黄斑纤维化发展中的贡献仍然尚未阐明。

研究目的

本研究旨在探讨Wnt信号通路，尤其是Wnt5a及β-catenin，在TGFβ1诱导的RPE细胞模型和激光诱导的小鼠CNV模型继发视网膜下纤维化病理过程的作用和可能机制。

研究方法与结果

本研究的第一作者刘丹丹博士利用激光诱导的小鼠模型和TGFβ1诱导的ARPE-19细胞模型，验证了靶向抑制Wnt5a/β-catenin正反馈环路的潜力，显示出在抗纤维化和抗EMT方面的显著效果。研究发现：

1.动物实验显示，玻璃体腔内注射Wnt/β-catenin抑制剂FH535可有效抑制激光诱导小鼠7天后CNV和视网膜下纤维化面积（图1），并显著抑制EMT（详见原文）。

图1.FH535对激光诱导的CNV小鼠7天后视网膜下纤维化、细胞EMT和CNV的影响。（A、C） 小鼠RPE-Bruch's膜-脉络膜复合体（RPE-Bruch's membrane-choriocapillaris complex, RBCC）组织铺片的免疫荧光显示FH535（0.5 μmol/L）玻璃体腔注射可抑制激光诱导小鼠第7天的视网膜下纤维化和CNV程度。纤维化和新生血管标志物分别由α-SMA、fibronectin、collagen I和IB4标记。（B、D）FH535对激光诱导的CNV小鼠视网膜下纤维化区域和新生血管化区域影响的定量分析。（E）小鼠RBCC组织铺片的免疫荧光染色显示FH535对CNV模型小鼠中fibronectin和RPE标记物RPE65的共染色效应。（F）FH535对CNV模型小鼠视下纤维化区域和RPE65阳性免疫荧光区域影响的定量分析。

2.动物实验进一步指出，玻璃体腔注射FH535显著抑制CNV小鼠RBCC组织中Wnt5a的高表达，而对Wnt3a水平无显著影响。玻璃体腔注射Wnt5a特异性拮抗剂Box5或FH535均有效抑制激光诱导小鼠21天后视网膜下纤维化、RPE细胞EMT的面积及active β-catenin的表达（图2，详见原文）。

图2.玻璃体内注射FH535或Box5对激光诱导CNV小鼠Wnt信号、EMT和视网膜下纤维化的影响。（A）Western blot检测小鼠激光诱导后的第3、7、14天时RBCC组织中Wnt5a、ROR1和Wnt3a的变化及FH535的作用。（B-D）图A中Wnt5a，ROR1及Wnt3a的Western blot定量分析。（E、G）在激光诱导后第21天，免疫荧光检测玻璃体内注射FH535（0.5 μmol/L）或Box5（90 μmol/L）对小鼠CNV病灶内active β-catenin、α-SMA、fibronectin及RPE65表达的影响。（F、H）图E、G中active β-catenin、α-SMA、fibronectin及RPE65的荧光强度的定量分析。

3.细胞实验进一步验证了动物实验的结果，即FH535能显著抑制TGFβ1诱导的RPE细胞EMT（图3）。

图3.FH535共孵育对TGFβ1处理的ARPE-19细胞EMT的影响。（A）代表性明场图像和免疫荧光结果展示了经过48小时处理后，Vehicle组、TGFβ1组、以及TGFβ1 + FH535（0.5μM）组中ARPE-19细胞的细胞形态，以及fibronectin、collagen I、vimentin和ZO-1蛋白的免疫荧光染色。（B-C）ARPE-19细胞经过TGFβ1或联合FH535处理48小时后，在各组间迁移的代表性图像和迁移数量的定量分析。（D）TGFβ1处理后在存在或不存在FH535的情况下，对ARPE-19细胞进行了划痕愈合实验，并在培养后0小时、24小时和48小时拍摄了代表性图像，黑色线条显示了划痕创口的边缘。（D）不同组之间ARPE-19细胞划痕愈合实验的统计结果。

4.在机制研究中，FH535、Box5或Wnt5a shRNA显著抑制TGFβ1诱导的ARPE-19细胞中Wnt5a及active β-catenin的表达以及ECM沉积的增加，而单独激活Wnt5a可诱导ARPE-19细胞中β-catenin和ECM沉积（图4-6），提示在TGFβ1处理的ARPE-19细胞中，Wnt5a和β-catenin的激活建立了一个相互促进的正反馈环路，即“Wnt5a/β-catenin环路”，显著增强了EMT过程。

图4.FH535（Wnt/β-catenin信号抑制剂）和Foxy-5（Wnt5a特异性激动剂）对ARPE-19细胞中Wnt信号通路和EMT的影响。（A）Western blot分析显示，在TGFβ1（10 ng/mL）单独处理或与FH535（0.5 μmol/L）或Foxy-5（50、100、200 μmol/L）联合处理，以及未处理的ARPE-19细胞中，fibronectin、Wnt5a、active β-catenin、Naked1、Dvl2和Wnt3a的表达情况。（B-F）对图A中Western blot结果进行定量分析。（G）Western blot分析显示，在TGFβ1（10 ng/mL）单独处理或与FH535（0.5 μmol/L）或Foxy-5（50、100、200 μmol/L）联合处理，以及未处理的ARPE-19细胞中，active β-catenin在细胞核和细胞质分别表达的情况。（H-I）分别对图G中ARPE-19细胞的胞核和胞浆中active β-catenin的表达进行定量分析；Lamin B1和GAPDH分别用作细胞核或细胞浆特异性的蛋白内参。（J-K）免疫荧光代表性图像显示纤维化标记fibronectin或active β-catenin在上述各组的表达情况。

图5.Box5对TGFβ1处理的ARPE-19细胞中EMT和Wnt信号相关分子表达谱的影响，以及对其迁移能力的影响。（A-E）ARPE-19细胞经不同浓度Box5或TGFβ1处理48小时后，其胞内fibronectin、Wnt5a、Dvl2和Naked1的蛋白水平表达。（F-H）各组ARPE-19细胞核提取物和细胞质提取物中active β-catenin蛋白的表达及定量分析。（I-J）ARPE-19细胞中EMT相关蛋白如fibronectin、vimentin、α-SMA、collagen I及active β-catenin在各组间的免疫荧光分析及细胞代表性明场图像。（K-L）细胞划痕法检测不同组间ARPE-19细胞的迁移能力。

图6.Wnt5a shRNA对TGFβ1处理的ARPE-19细胞中EMT和Wnt信号相关分子表达谱的影响。表达对照shRNA、Wnt5a shRNA-1或-2的ARPE-19细胞用TGFβ1处理48小时。采用qRT-PCR（A-D）和Western blot（E-H）检测Wnt5a、fibronectin、α-SMA、collagen I和active β-catenin的mRNA或蛋白表达水平。

研究结论

该研究的分子机制图（图7）揭示了在EMT和nAMD继发视网膜下纤维化过程中“Wnt5a/β-catenin”形成的一个正向反馈环路。TGFβ1诱导了非经典Wnt配体Wnt5a的上调以及经典β-catenin信号通路的激活，这两者相互作用并潜在地放大了疾病信号，进而促进了EMT和视网膜下纤维化的发生发展。该研究提示，通过在EMT过程中针对Wnt5a/β-catenin环路的激活进行靶向抑制，可能为治疗nAMD继发视网膜下纤维化提供一种新的治疗策略。

图7. 分子机制图

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38532410/

作者介绍

通讯作者：张敬法教授

上海市眼科研究所副所长。研究员，副主任医师，博士研究生导师，哈佛大学医学院博士后，上海市浦江人才。上海市医学会眼科专科分会视觉研究学组组长、中国医师协会眼科医师分会第五届委员会基础研究与临床转化副主任委员（兼秘书）、中国老年医学学会眼科分会青年委员会副主任委员、上海市生物医药行业协会精准医疗专业委员会常委等。临床及科研方向为眼底病发病机制及治疗，聚焦糖尿病视网膜病变和年龄相关性黄斑变性。

通讯作者：徐国彤教授

医学博士、药学博士。同济大学特聘教授、同济大学新生院济人学堂执行院长、同济大学医学眼科研究所所长、华东干细胞库主任。曾任同济大学生命医学学部副主任和医学院院长。

主要研究老年性眼病和衰老机制以及抗衰老研究。包括视网膜变性的干细胞治疗、白内障发病机制及药物治疗，糖尿病视网膜病变发病机制和创新疗法研发。先后负责和参加国家级科研项目十余次（包括两次担任重大科学研究计划干细胞项目的首席科学家和一次国际合作重大项目的首席科学家），发表研究论文150余篇，包括在国际期刊发表的论文约120篇，被引用逾2000次；主编/副主编干细胞及眼科专著和教材5本，申请专利约30余项且大部分已获授权；中国细胞生物学学会干细胞生物学分会首任会长、理事，中国医师协会眼科分会基础研究与临床转化学组组长、海医会眼科分会常委及干细胞学组组长等。担任Curr Mol Med、《中华细胞与干细胞杂志》等杂志副主编。获中美眼科和视觉研究贡献奖、卫生部有突出贡献中青年专家、宝钢优秀教师奖、第47届日内瓦国际发明展银奖等。

通讯作者：张朝阳博士

医学博士。上海市第一人民医院眼科助理研究员。上海市医学会眼科专科分会视觉研究学组组员。科研方向为糖尿病视网膜病变和年龄相关性黄斑变性的发病机制及治疗。主持国自然青年项目1项；以第一作者和共同通讯作者发表SCI论文7篇。相关论文发表在Invest Ophthalmol Vis Sci、Pharmacol Res、Phytomedicine等杂志上。

第一作者：刘丹丹 博士研究生

上海市同济大学医学院在读博士。科研方向为糖尿病视网膜病变和年龄相关性黄斑变性的发病机制及治疗。已发表SCI论文13篇，其中以第一作者发表在J Neuroinflammation、Neural Regen Res、Life sciences、Neurobiol Dis等杂志上。

参考文献：

[1] CHEN Q, JIANG N, ZHANG Y, et al. Fenofibrate Inhibits Subretinal Fibrosis Through Suppressing TGF-β-Smad2/3 signaling and Wnt signaling in Neovascular Age-Related Macular Degeneration [J]. Frontiers in pharmacology, 2020, 11: 580884.

[2]MA X, TAKAHASHI Y, WU W, et al. Soluble very low-density lipoprotein receptor (sVLDLR) inhibits fibrosis in neovascular age-related macular degeneration [J]. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology, 2021, 35(12): e22058.

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