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Fuchs角膜内皮营养不良与紫外线的关系

2020-05-13 17:13:00
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角膜内皮（corneal endothelium，CE）位于角膜后部，不断泵送离子，作为角膜基质和房水之间的屏障，在维持角膜清晰度方面起关键作用。CE在体内增殖能力有限，因此，细胞损失超过一定数量时会导致角膜水肿，需要通过角膜移植来恢复视力。Fuchs角膜内皮营养不良（FECD）是内源性CE细胞丢失的最常见原因，是一种年龄相关的复杂遗传疾病，表现为细胞外基质沉积的形成和CE细胞凋亡。角膜直接受到紫外线（UV）的照射，与周边区域相比，中央角膜受到的紫外线照射要多得多。其中UVA（波长320-400nm）是通过产生活性氧（ROS）来制造大分子毒性的。而由于高代谢活性和增殖中止，CE特别容易受到紫外线辐射的损害，这是由于（核）氧化DNA损伤的增加积累所导致的，且中央区角膜更容易老化。研究者之前的研究表明，FECD发病机制的基础是DNA损伤的慢性积累，包括线粒体（mtDNA）和细胞核（nDNA）损伤，进而导致FECD线粒体功能障碍和细胞凋亡。但是紫外线在FECD中引起DNA损伤和内皮细胞变性的机制还没有被研究过。

另外FECD很重要的特点是女性患病率更高，且病情更严重。一种可能的原因是雌性激素可能在疾病发生发展中起作用，并加重疾病表型。但是目前没有明确的研究报导过。因此研究者通过研究基于UV诱导雌激素代谢和DNA损伤的机制，来探索这些因素是如何增加女性FECD的发病率和严重程度的。相关研究结果发表在PNAS上。

FECD的临床特征是中央角膜区形成穹顶状的细胞外基质沉积和CE细胞损失（图1A，中间为裂隙灯图片，右边为共聚焦图片）。而周边角膜区域由于眼睑能遮挡UV，所以病变相对较少。研究者建立了一个UVA诱导的晚发FECD小鼠模型。在不同强度（250、500、750和1000 J/cm2）的照射下，小鼠右眼的角膜受到365 nm波长的照射。在照射后不同时间点用活体共聚焦显微镜观察小鼠角膜内皮细胞（MCEnC）的形态和密度（图1B）。UVA造成了 CE细胞的减少，从每平方毫米大约2200个到大约900个，且与UVA的强度和时间相关（图1C）。

此外，UVA可导致细胞外基质沉积（红色箭头，图1B），与人类内皮细胞形态变化相似（图1A右侧图片）。其中雌性小鼠CE的形态学改变比同一时间点的雄性小鼠更重，如细胞体积增大、细胞丢失等（图1B）。在UV照射后3月，对CE细胞进行紧密连接的细胞染色，用于形态学的分析，发现雌性小鼠的CE细胞数量在不同强度的照射下均低于雄性小鼠（图2A）。这些结果均说明相比同类的雄性，雌性更容易受到UVA的损害。

图1. A：人类患者FECD表现 B,C：UVA照射下MCEnC形态改变和细胞密度下降

N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）具有抗氧化和清除ROS的特性。而既往也被证明在FECD中具有细胞保护的作用。因此研究者在1000 J/cm2UVA照射的前一天同时使用NAC，发现与单纯照射相比，MCEnC密度在雌性小鼠(1521 ± 313, NAC vs. 855 ± 115, 非NAC)和雄性小鼠(1560 ± 136, NAC vs. 944 ± 136, 非NAC)中均升高（图1C）。这说明补充NAC能显著挽救FECD内皮细胞，这表明清除ROS可恢复UVA诱导的细胞损失（图2A）。

CE细胞的功能紊乱可导致角膜水肿，而使中央角膜厚度（CCT）增厚。对UVA照射的MCEnC进行CCT的测量。最初由于上皮细胞的损伤，CCT增厚，1周后上皮细胞恢复。而之后CCT增加，且UVA强度越强，CCT越厚（图2B和C）。而在1000 J/cm2UVA照射下使用NAC，能明显减少CCT（图2C）。

图2. UVA照射改变细胞大小，形状和CCT

为了确定UVA是否影响临近CE的眼内环境，研究者分析比较了小鼠和人类房水中的ROS产物（图3A-C）。相比正常小鼠，UVA照射的雌性和雄性小鼠房水中的H2O2含量明显升高（图3A）而NAC的使用能明显减少ROS的形成（图3B）。而人类患者房水中H2O2含量也明显升高（图3C）。这说明氧化的环境能影响FECD的发生发展。在体外对MCEnC进行DNA氧化标记物（8-OHdG）的免疫荧光检测（图3D），进一步验证结果。而在UVA照射3月后，进行TUNEL实验检测DNA裂解和细胞自噬情况。发现在750 J/cm2和1000 J/cm2UVA照射下细胞为TUNEL阳性（图3E和F）。而250 J/cm2的检测为阴性。而使用NAC治疗下TUNEL阳性细胞也明显减少（图3E）。

接下来研究者推测UVA对DNA损伤作用的不同反应可能可以解释FECD表型的性别差异。对MCEnC进行LA-qPCR分析（nDNA和mtDNA的损害），比较雌性和雄性小鼠的差异。在雌鼠和雄鼠MCEnCs中，UVA分别通过降低mtDNA的扩增来诱导mtDNA的损伤（图3G和J）。mtDNA损伤在2周后恢复，然后仅在雌性小鼠中出现第二次高峰。这提示在最初的损伤修复后，继发性大分子损伤出现在雌性小鼠中而不出现在雄性小鼠中。对nDNA位点的分析显示，雌性小鼠的损伤比雄性小鼠更早更严重（图3H-J）。而NAC的治疗显示对nDNA的损伤有效果，而对雌性小鼠的mtDNA损伤无治疗效果（图3G-I）。在永生化的人类正常CE细胞系（HCEnC-21T）中加入4-OHE2（4-羟雌二醇）来模仿细胞里女性的内环境。发现 nDNA和mtDNA均有明显的损害（图3K）。对MCEnC进行透射电镜检查显示含有线粒体的液泡数量和大小增加（图3L-N），说明与对照组相比，UVA处理的MCEnCs中自噬结构的形成增多。

图3. UVA照射可诱导MCEnCs中的ROS、DNA损伤、线粒体肿胀和细胞凋亡

基于以上发现，研究者对雌激素代谢是否参与了FECD的发展进行了研究（图4A）。发现与正常供体角膜组织相比，体外FECD患者标本中CYP1B1蛋白水平显著上调（图4B）。将正常CE细胞进行5J/cm2UVA处理，发现在照射后，CYP1B1明显上调（图4C）。而CYP1B1在线粒体和细胞质部分表达上调（图4D）。在1000J/cm2UVA照射1天后的雌性小鼠中CYP1B1表达升高，而雄性小鼠没有（图4E）。由于CYP1B1可促使雌二醇转化为4-羟雌二醇，随后产生儿茶酚类雌激素和去嘌呤DNA复合物（图4A）。对同一只小鼠右眼进行UVA处理，左眼空白对照，发现4-羟雌二醇表达明显升高（图4F）。4-羟雌二醇-DNA复合物表达明显升高（图4G）。以上结果证明了UVA处理的雌性小鼠CYP1B1的差异上调导致内源性雌激素代谢紊乱。这导致了DNA复合物的积累，很好的模拟了FECD患者中DNA的损伤。

图4. UVA照射通过增强CYP1B1的表达水平诱导女性体内的雌激素代谢物

综上所述，本研究探讨了环境因素在FECD中的分子机制，并证明了在FECD发生发展过程中UVA诱导的雌激素代谢与FECD女性易感之间的密切关系。

参考文献：Liu C, Miyajima T, Melangath G et al. Ultraviolet A light induces DNA damage and estrogenDNA adducts in Fuchs endothelial corneal dystrophy causing females to be more affected. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020 Jan

点评

姜洋

北京协和医院

Fuchs角膜内皮营养不良是一种基因异常所导致的进行性角膜内皮疾病。目前越来越多的研究证实角膜内皮营养不良的临床症状出现在此类患者的中老年期，主要是由于紫外线对角膜内皮细胞的进行性损伤的累积作用高度相关的。同时，亦有多篇相关的研究证实，紫外线的角膜内皮细胞损伤作用在雌性组群更加严重。同年龄组、相同程度的紫外线暴露下，雌性组群较雄性组群更所产生的内皮细胞损伤更加剧烈。此研究在永生化的人类正常CE细胞系（HCEnC-21T）中应用4-OHE2（4-羟雌二醇）来模仿细胞里女性的内环境，发现 nDNA和mtDNA均有明显的损害。研究者在此基础上进一步应用观察，发现体外FECD患者标本中CYP1B1蛋白水平上调。基于此观察结果，研究团队通过UVA照射诱导的动物模型证实雌性小鼠CYP1B1表达有所升高，而雄性小鼠则没有。从而推证UVA暴露损伤后雌性组群CYP1B1差异上调的表达导致内源性雌激素代谢紊乱，造成的DNA复合物的积累是女性FECD患者临床易感的原因，为临床中FECD疾病高度的临床性别表现差异做出了科学的探讨，从而为未来针对性的治疗研究有高度的指导性作用。

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